Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie metod przeprowadzania badań właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów chemicznych

W rozporzàdzeniu Ministra Zdrowia z dnia a) pozycja B.1.BIS. otrzymuje brzmienie okreÊlone 28lipca 2003 r. wsprawie metod przeprowadzania ba- w za∏àczniku nr 3 do niniejszego rozporzàdze- daƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci nia, i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicz- nych (Dz. U. Nr 232, poz. 2343) wprowadza si´ nast´- b) pozycja B.1.TRIS. otrzymuje brzmienie okreÊlo- pujàce zmiany w za∏àczniku do rozporzàdzenia: ne w za∏àczniku nr 4 do niniejszego rozporzà- dzenia, 1) „Spis metod” otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 1 do niniejszego rozporzàdzenia; c) pozycja B.4. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 5 do niniejszego rozporzàdze- 2) w cz´Êci A po pozycji „A.20 Rozpuszczanie/eks- nia, trakcja polimerów w wodzie” dodaje si´ pozycj´ d) pozycja B.5. otrzymuje brzmienie okreÊlone ——————— w za∏àczniku nr 6 do niniejszego rozporzàdze- 1)Minister Zdrowia kieruje dzia∏em administracji rzàdowej nia, — zdrowie, na podstawie § 1 ust. 2 rozporzàdzenia Preze- sa Rady Ministrów z dnia 31 paêdziernika 2005 r. w spra- e) pozycja B.31. otrzymuje brzmienie okreÊlone wie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Zdrowia w za∏àczniku nr 7 do niniejszego rozporzàdze- (Dz. U. Nr 220, poz. 1901). nia, 2)Niniejsze rozporzàdzenie dokonuje w zakresie swojej re- gulacji wdro˝enia dyrektywy 2004/73/WE z dnia 29 kwiet- f) pozycja B.35. otrzymuje brzmienie okreÊlone nia 2004 r. dostosowujàcej po raz 29 do post´pu technicz- w za∏àczniku nr 8 do niniejszego rozporzàdze- nego dyrektyw´ 67/548/EWG w sprawie zbli˝enia przepi- nia, sów ustawowych, wykonawczych iadministracyjnych od- noszàcych si´ do klasyfikacji, pakowania i etykietowania g) po pozycji „B.41. FototoksycznoÊç in vitro — substancji niebezpiecznych (Dz. Urz. WE L 152 test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3” dodaje z30.04.2004 r.). si´ pozycje: 3)Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U. — „B.42. Uczulanie skóry: próba na miejsco- z 2001 r. Nr 100, poz. 1085, Nr 123, poz. 1350 i Nr 125, wym w´êle ch∏onnym” wbrzmieniu okreÊlo- poz. 1367, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 142, poz. 1187, z 2003 r. Nr 189, poz. 1852, z 2004 r. Nr 96, poz. 959 nym w za∏àczniku nr 9 do niniejszego rozpo- iNr121, poz. 1263 oraz z2005 r. Nr 179, poz. 1485. rzàdzenia,</td></tr><tr><td>——————— 1)Minister Zdrowia kieruje dzia∏em administracji rzàdowej — zdrowie, na podstawie § 1 ust. 2 rozporzàdzenia Preze- sa Rady Ministrów z dnia 31 paêdziernika 2005 r. w spra- wie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Zdrowia (Dz. U. Nr 220, poz. 1901). 2)Niniejsze rozporzàdzenie dokonuje w zakresie swojej re- gulacji wdro˝enia dyrektywy 2004/73/WE z dnia 29 kwiet- nia 2004 r. dostosowujàcej po raz 29 do post´pu technicz- nego dyrektyw´ 67/548/EWG w sprawie zbli˝enia przepi- sów ustawowych, wykonawczych iadministracyjnych od- noszàcych si´ do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych (Dz. Urz. WE L 152 z30.04.2004 r.). 3)Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U. z 2001 r. Nr 100, poz. 1085, Nr 123, poz. 1350 i Nr 125, poz. 1367, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 142, poz. 1187, z 2003 r. Nr 189, poz. 1852, z 2004 r. Nr 96, poz. 959 iNr121, poz. 1263 oraz z2005 r. Nr 179, poz. 1485.</td></tr></tbody></table></div>

— „B.43 Badanie neurotoksycznoÊci na gryzo- c) „C.23. Przemiany tlenowe i beztlenowe w gleniach” wbrzmieniu okreÊlonym wza∏àczniku bie” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 10 do niniejszego rozporzàdzenia; nr 13 do niniejszego rozporzàdzenia, 4) w cz´Êci C po pozycji „C.20. Rozmna˝anie rozwie- d) „C.24. Przemiany tlenowe i beztlenowe w osalitki (Daphnia magna sp.)” dodaje si´ pozycje: dach wodnych” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 14 do niniejszego rozporzàdzea) „C.21. Mikroorganizmy glebowe: Badanie prze- nia. mian azotu” — w brzmieniu okreÊlonym w za- ∏àczniku nr 11 do niniejszego rozporzàdzenia,

Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie 14 dni od dnia og∏oszenia. b) „C.22. Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian w´gla” — w brzmieniu okreÊlonym w za- ∏àczniku nr 12 do niniejszego rozporzàdzenia, Minister Zdrowia: Z. Religa Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia zdnia 21 listopada 2005 r. (poz. 2119) Za∏àcznik nr 1 SPIS METOD Cz´Êç A. Metody przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych A.1. Temperatura topnienia/krzepni´cia A.2. Temperatura wrzenia A.3. G´stoÊç wzgl´dna A.4. Pr´˝noÊç par A.5. Napi´cie powierzchniowe A.6. RozpuszczalnoÊç w wodzie A.8. Wspó∏czynnik podzia∏u A.9. Temperatura zap∏onu A.10. PalnoÊç (substancje i preparaty chemiczne sta∏e) A.11. PalnoÊç (gazy) A.12. PalnoÊç (w kontakcie z wodà) A.13. W∏aÊciwoÊci piroforyczne cia∏ sta∏ych i cieczy A.14. W∏aÊciwoÊci wybuchowe A.15. Temperatura samozap∏onu (ciecze i gazy) A.16. Wzgl´dna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych sta∏ych A.17. W∏aÊciwoÊci utleniajàce (substancje/preparaty chemiczne sta∏e) A.18. Liczbowo Êrednia masa czàsteczkowa i rozk∏ad masy czàsteczkowej polimerów A.19. ZawartoÊç polimerów o ma∏ej masie czàsteczkowej A.20. Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie A.21. W∏aÊciwoÊci utleniajàce (ciecze) Cz´Êç B. Metody oznaczania toksycznoÊci i innych skutków zdrowotnych B.1.BIS. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Ustalonej Dawki B.1.TRIS.ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Klas ToksycznoÊci Ostrej B.2. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) B.3. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) B.4. ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na skór´ B.5. ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oko B.6. ToksycznoÊç ostra (uczulenie skóry) B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa) B.8. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna) B.9. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skór´) B.10. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych in vitro na komórkach ssaków) B.11. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych na komórkach szpiku kostnego ssaków) B.12. MutagennoÊç (test mikrojàdrowy na erytrocytach ssaków in vivo) B.13/14. MutagennoÊç (test rewersji mutacji na bakteriach) B.15. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.16. MutagennoÊç (test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.17. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach ssaków)

B.18. Uszkodzenie i naprawa DNA — Nieplanowa synteza DNA — Badanie na komórkach ssaków in vitro B.19. Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro B.20. Recesywne mutacje letalne zwiàzane z p∏cià u Drosophila melanogaster B.21. Transformacja komórek ssaków in vitro B.22. Dominujàce mutacje letalne u gryzoni B.23. Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków B.24. Test plamkowy u myszy B.25. Test dziedzicznych translokacji u myszy B.26. ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie gryzoni drogà pokarmowà) B.27. ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie drogà pokarmowà zwierzàt zgatunków innych ni˝ gryzonie) B.28. ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie przez skór´ (90-dniowe powtarzane nara˝enie na skór´ u gryzoni) B.29. ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie inhalacyjne (90-dniowe powtarzane nara˝enie inhalacyjne u gryzoni) B.30. ToksycznoÊç przewlek∏a B.31. Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym B.32. Dzia∏anie rakotwórcze B.33. ToksycznoÊç przewlek∏a/dzia∏anie rakotwórcze B.34. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu jednopokoleniowego B.35. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego B.36. Toksykokinetyka B.37. Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po nara˝eniu ostrym B.38. Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po dawce powtarzanej — 28-dniowej B.39. Nieplanowana synteza DNA na komórkach wàtroby ssaków B.40. Dzia∏anie ˝ràce na skór´ B.41. FototoksycznoÊç in vitro — test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3 B.42. Uczulanie skóry: próba na miejscowym w´êle ch∏onnym B.43. Badanie neurotoksycznoÊci na gryzoniach Cz´Êç C. Metody przeprowadzenia badaƒ ekotoksycznoÊci C.1. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) C.2. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) C.3. Hamowanie wzrostu glonów C.4. PodatnoÊç na biodegradacj´ C.4.I. Uwagi ogólne C.4.II. Zanikanie RWO (Metoda C.4—A) C.4.III. Zmodyfikowane badanie przesiewowe wg OECD (Metoda C.4—B) C.4.IV. Wydzielanie CO (Metoda C.4—C) 2 C.4.V. Metoda respirometrii manometrycznej (Metoda C.4—D) C.4.VI. Metoda naczynia zamkni´tego (Metoda C.4—E) C.4.VII. Metoda M.I.T.I. (Metoda C.4—F) C.5. Degradacja — biochemiczne zapotrzebowanie na tlen C.6. Degradacja — chemiczne zapotrzebowanie na tlen C.7. Degradacja — abiotyczny rozk∏ad przez hydroliz´ w zale˝noÊci od pH C.8. ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badanie w sztucznej glebie C.9. Biodegradacja. Test Zahn-Wellensa C.10. Biodegradacja. Badania symulacyjne osadu czynnego C.11. Biodegradacja. Badania stopnia hamowania oddychania osadu czynnego C.12. Biodegradacja. Zmodyfikowany test SCAS C.13. Biokoncentracja. Badanie przep∏ywowe na rybach C.14. Badanie wzrostu narybku C.15. Krótkoterminowa toksycznoÊç na zarodkach ryb i stadiach narybku C.16. Badanie toksycznoÊci ostrej drogà pokarmowà na pszczo∏ach miodnych C.17. Badanie toksycznoÊci ostrej kontaktowej na pszczo∏ach miodnych C.18. Adsorpcja/desorpcja metodà wyznaczania stanu równowagi C.19. Wyznaczanie wspó∏czynnika adsorpcji (K) na glebie i osadzie Êciekowym za pomocà chromatogra- OC fii cieczowej (HPLC) C.20. Rozmna˝anie rozwielitki (Daphnia magna sp.) C.21. Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian azotu C.22. Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian w´gla C.23. Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie C.24. Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych

˝y pozostawiç do och∏odzenia przed ostro˝nym roze- 2. WYNIKI braniem urzàdzenia, stosujàc zabezpieczenia przed dzia∏aniem nadciÊnienia, które mo˝e w nim wyst´po- Czas narastania ciÊnienia zarówno dla substancji waç. Wykonuje si´ pi´ç prób z cieczà badanà i sub- badanej i substancji kontrolnej(ych). Czas narastania stancjà(ami) kontrolnà(ymi). Zapisuje si´ czas narasta- ciÊnienia zbadaƒ zmateria∏em oboj´tnym, oile zostania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnie- ∏y przeprowadzone. nia atmosferycznego. Potem oblicza si´ Êredni czas 2.1. Opracowanie wyników narastania ciÊnienia. Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia dla cie- W pewnych przypadkach ciecze mogà powodoczy badanej i substancji kontrolnej(ych). waç wzrost ciÊnienia (zbyt wysoki lub zbyt niski), spowodowany przez reakcje chemiczne nieb´dàce cha- Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia z barakterystycznymi dla w∏aÊciwoÊci utleniajàcych. W ta- daƒ zmateria∏em oboj´tnym (oile zosta∏y przeprowakich przypadkach mo˝e byç konieczne powtórzenie dzone). badania zmateria∏em oboj´tnym, np. diatomitem (ziemià okrzemkowà), zast´pujàcym celuloz´ wcelu wyja- Niektóre przyk∏ady wyników podano w tabeli Ênienia rodzaju reakcji. A.21.1. Tabela A.21.1. Przyk∏ady wynikówd)

— porównania Êredniego czasu przyj´tego dla nara- W celu unikni´cia fa∏szywie pozytywnych wynistania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa zsubstan- ków, je˝eli to konieczne, powinny byç równie˝ cjà(ami) kontrolnà(ymi). uwzgl´dnione przy ich interpretacji wyniki uzyskane Ciecz uwa˝a si´ za utleniajàcà, je˝eli: podczas badania cieczy z materia∏em oboj´tnym. — mieszanina 1:1 (masowo), cieczy i celulozy zapala 4. PIÂMIENNICTWO si´ samorzutnie lub — mieszanina 1:1 (masowo) cieczy icelulozy wykazu- 1) Recommendations on the Transport of Dangerous je Êredni czas narastania ciÊnienia mniejszy lub Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised równy Êredniemu czasowi narastania ciÊnienia dla edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. mieszaniny 1:1 masowo, 65 % (masowo) wodne- 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liqugo roztworu kwasu azotowego i celulozy. ids. Rysunek A.21.1. Naczynie ciÊnieniowe

Rysunek A.21.2. Urzàdzenie podtrzymujàce Rysunek A.21.3. Uk∏ad zapalajàcy A Spirala zapalajàca B Izolacja C Elektrody D G∏owiczka zapalajàca Uwaga: mogà byç stosowane oba te ustawienia.

LD (medialna dawka Êmiertelna):jest statystycz- Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe 50 nie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spo- osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjwoduje Êmierç 50 % zwierzàt po podaniu drogà po- nych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne. karmowà. WartoÊç LD jest wyra˝ana wpostaci masy Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno 50 badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy byç wwieku 8 do 12 tygodni, ajego masa powinna zabadanego zwierz´cia (mg/kg). wieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednio nara˝anych zwierzàt. Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg). 1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt Prognozowane padni´cie: wyst´powanie obja- Temperatura wpomieszczeniach doÊwiadczalnych wów klinicznych Êwiadczàcych o padni´ciu w przewi- powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna podywalnym okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem za- winna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odkoƒczenia doÊwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia chyleniach mi´dzy 30 % a70 % (wy˝sza wartoÊç jedywody lub spo˝ywania paszy (bardziej szczegó∏owy nie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosoopis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance waç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 go- Document, zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). dzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapew- 1.3. Zasada metody badawczej niç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej daw- Grupy zwierzàt jednej p∏ci nara˝ane sà wed∏ug ki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie moprocedury etapowej przy zastosowaniu ustalonych ˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´- dawek 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (wyjàtkowo mo˝e byç cia. brana pod uwag´ dodatkowa dawka 5000 mg/kg, zobacz pkt 1.6.2). Poziom dawki poczàtkowej jest wybie- 1.4.3. Przygotowanie zwierzàt rany na podstawie badania wst´pnego ijest to dawka, która powinna powodowaç wystàpienie pewnych ob- Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla jawów toksycznoÊci, jednak bez wystàpienia jej umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu ostrych skutków lub ÊmiertelnoÊci. Objawy kliniczne aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzyi warunki powiàzane z wystàpieniem bólu, cierpienia mywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpoi nieuchronnego padni´cia sà szczegó∏owo opisane cz´ciem podawania substancji. w oddzielnych Wytycznych OECD (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Nast´pne grupy zwierzàt mogà byç 1.4.4. Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji nara˝ane na badanà substancj´ podawanà w wy˝- i ich podawanie szych lub ni˝szych ustalonych dawkach, w zale˝noÊci od wyst´powania lub niewyst´powania objawów tok- Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od sycznoÊci lub ÊmiertelnoÊci. Procedura ta jest konty- dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci ponuowana a˝ do podania substancji wdawce powodu- przez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu. jàcej widoczne objawy toksycznoÊci lub do momentu, Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub gdy stwierdzi si´ nie wi´cej ni˝ jeden przypadek pad- mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej ni´cia lub gdy wnajwy˝szej dawce nie notuje si´ ˝ad- badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç nych skutków, bàdê te˝ padni´cie wyst´puje w dawce bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre najni˝szej. urz´dy dla nast´pujàcej wdalszej kolejnoÊci oceny ryzyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie 1.4. Opis metody badawczej nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e 1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ 1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztwomogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni. rów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç Wbadaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozy- 2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to cja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawanew literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u- go preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie ˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD, które wykazujà, ˝e wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej 50 zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje pomi´dzy samcami asamicami gryzoni; awtych przy- w oleju (np.: oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci padkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10 znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝ piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza otoksykologicznych lub woda. toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopo- Podawane roztwory muszà byç przygotowane dobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe, na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilwówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci. noÊç preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w ja- Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç kim przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowyraêne uzasadnienie. walna.

1.5. Sposób post´powania jest zakoƒczenie badaƒ iprzypisanie substancji do Kategorii 1 wg GHS (jak przedstawiono w Schemacie 1). 1.5.1. Podawanie substancji Je˝eli wymagane jest dalsze potwierdzenie tej klasyfikacji, mo˝na przeprowadziç dodatkowà procedur´, na- Badana substancja jest podawana jednorazowo ra˝ajàc drugie zwierz´ w dawce 5 mg/kg. Je˝eli i to wpojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej zwierz´ padnie, wówczas potwierdza si´ zaklasyfikolub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku wanie substancji do Kategorii 1 wg GHS inatychmiast gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe, koƒczy badanie. Je˝eli drugie zwierz´ prze˝yje, wówmo˝e byç ona podana wporcjach, przy czym czas po- czas nara˝ane sà maksymalnie trzy dodatkowe zwiedania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin. rz´ta w dawce 5 mg/kg. Ze wzgl´du na wysokie ryzyko ÊmiertelnoÊci, w celu zapobie˝enia zb´dnym cier- Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji po- pieniom, zwierz´ta powinny byç nara˝ane jedno po winny byç g∏odzone (np. wprzypadku szczurów pozo- drugim. Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substawia si´ wod´, ale paszy nie podaje si´ w nocy; stancji w kolejnych dawkach powinien byç wystarczaw przypadku myszy pozostawia si´ wod´, a paszy nie jàcy do ustalenia, czy poprzednie zwierz´ mo˝e przepodaje si´ w okresie 3—4 godzin przed doÊwiadcze- ˝yç. Je˝eli padnie drugie zwierz´, natychmiast wstrzyniem). Po okresie g∏odzenia nale˝y zwierz´ta zwa˝yç muje si´ podawanie substancji w kolejnych dawkach, ipodaç im badanà substancj´. Po podaniu substancji, a badanie si´ koƒczy. Wystàpienie przypadku drugiew przypadku szczurów, pasz´ podaje si´ po up∏ywie go padni´cia (bez wzgl´du na liczb´ zwierzàt pozosta- 3—4 godzin, a w przypadku myszy po up∏ywie ∏ych przy ˝yciu wmomencie zakoƒczenia badania) po- 1—2 godzin. Je˝eli substancje podaje si´ w porcjach woduje zaklasyfikowanie substancji do wyniku A w ciàgu pewnego okresu, wówczas w zale˝noÊci od (2 lub wi´cej padni´ç), przestrzegana jest zasada klad∏ugoÊci trwania tego okresu mo˝e okazaç si´ koniecz- syfikacji wg Schematu 2 w ustalonej dawce 5 mg/kg ne dostarczenie zwierz´tom wody i paszy. (Kategoria 1 — je˝eli wystàpi∏y 2 lub wi´cej przypadki padni´ç lub Kategoria 2 — je˝eli nie wystàpi∏ wi´cej 1.5.2. Badanie wst´pne ni˝ 1 przypadek padni´cia). Ponadto Schemat 3 przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug systemu Celem badania wst´pnego jest ustalenie w∏aÊci- UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu wej dawki poczàtkowej stosowanej wbadaniu w∏aÊci- GHS. wym. Badana substancja jest podawana pojedynczym zwierz´tom w sposób sekwencyjny wed∏ug schema- 1.5.3. Badanie w∏aÊciwe tów zamieszczonych w Schemacie 1. Badanie wst´pne koƒczy si´, gdy mo˝na podjàç decyzj´ co do wybo- 1.5.3.1. Liczba zwierzàt i poziomy dawek ru dawki poczàtkowej stosowanej w badaniu w∏aÊciwym lub gdy wnajni˝szej ustalonej dawce obserwuje Dzia∏ania, które nale˝y podjàç po badaniu wst´psi´ padni´cie badanych zwierzàt. nym, podane sà wSchemacie 2. Konieczne b´dzie dokonanie wyboru jednej ztrzech mo˝liwoÊci: zaprzesta- Dawka poczàtkowa do badania wst´pnego jest nie badaƒ i przypisanie substancji do odpowiedniej wybierana z ustalonych poziomów 5, 50, 300 klasy zagro˝enia, badanie w wy˝szej ustalonej dawce i2000mg/kg jako dawka majàca spowodowaç widocz- lub badanie wni˝szej ustalonej dawce. Jednak˝e wcenà toksycznoÊç, jeÊli mo˝na to przewidzieç na podsta- lu oszcz´dzenia cierpieƒ zwierz´tom dawka powoduwie wyników badaƒ in vivo i in vitro tej samej sub- jàca padni´cia wbadaniu wst´pnym nie mo˝e byç postancji lub substancji podobnej strukturalnie. W przy- wtarzana w badaniu w∏aÊciwym (zobacz Schemat 2). padku braku takich informacji dawkà poczàtkowà b´- DoÊwiadczenie wykazuje, ˝e najbardziej prawdopodzie 300 mg/kg. dobnym wynikiem badania substancji w dawce poczàtkowej b´dzie mo˝liwoÊç sklasyfikowania jej i dal- Pomi´dzy nara˝aniem kolejnych zwierzàt powi- sze doÊwiadczenia nie b´dà konieczne. nien byç zachowany odst´p wynoszàcy przynajmniej 24 godziny. Wszystkie zwierz´ta powinny byç obser- Dla ka˝dej badanej dawki nale˝y u˝yç pi´ciu zwiewowane przez przynajmniej 14 dni. rzàt jednej p∏ci. WÊród tych pi´ciu zwierzàt powinno znajdowaç si´ jedno zwierz´, któremu podawana by∏a W wyjàtkowych sytuacjach, usprawiedliwionych substancja w odpowiednio ustalonej dawce w trakcie tylko szczególnymi wymaganiami prawnymi, mo˝na badania wst´pnego, oraz cztery dodatkowe zwierz´ta rozwa˝aç zastosowanie dodatkowej, wy˝szej dawki (z wyjàtkiem sytuacji, gdy dawka stosowana w bada- 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). W celu zapobie˝e- niu g∏ównym nie by∏a stosowana w badaniu wst´pnia nadmiernym cierpieniom zwierzàt nie jest zaleca- nym). ne badanie w zakresach Kategorii 5 wg GHS (dawki 2000 do 5000 mg/kg). Powinno byç ono brane pod Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substanuwag´ tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodo- cji wkolejnych dawkach jest okreÊlony przez pojawiebieƒstwo, ˝e wyniki takiego badania b´dà mia∏y istot- nie si´, czas trwania inasilenie objawów toksycznoÊci. ne znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt. Badanie zwierzàt poprzez nara˝anie na substancj´ w kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu W przypadkach gdy badane zwierz´ nara˝one uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio narawbadaniu wst´pnym na substancj´ wnajni˝szej usta- ˝onych zwierzàt. Zalecany jest okres przerwy trwajàcy lonej dawce (5 mg/kg) padnie, wskazanà procedurà 3 do 4 dni pomi´dzy podawaniem substancji w kolej-

nych dawkach, aby umo˝liwiç zaobserwowanie obja- targu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady wów opóênionej toksycznoÊci. Odst´p czasowy powi- i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Donien byç w∏aÊciwie dostosowany np. wprzypadku nie- cument (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zwierz´ta dajàcych si´ wyjaÊniç reakcji. w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmierco- Gdy pod uwag´ bierze si´ zastosowanie najwy˝- ne. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y szej ustalonej dawki 5000 mg/kg, to powinna byç sto- mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia. sowana procedura podana w Kryteriach Klasyfikacji (zobacz tak˝e pkt 1.6.2.). 1.6.1. Masa cia∏a 1.5.3.2. Badanie dawki granicznej Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawa- Badanie dawek granicznych wykonywane jest nia badanej substancji i nast´pnie powinny byç okrew sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiad- Êlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy ciaczenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest ∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych, zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny je uÊmierwymaganych przez prawo poziomów. Informacje ciç. o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarów- 1.6.2. Badania patologiczne no pod wzgl´dem to˝samoÊci sk∏adników, jak isk∏adu procentowego produktów. W przypadku braku infor- Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane badamacji o toksycznoÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badaniom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które ny materia∏ jest toksyczny, nale˝y przeprowadziç bapadnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powodanie w∏aÊciwe. dów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwie- Stosujàc typowà procedur´ do badania wst´pnerz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopogo z zastosowaniem dawki poczàtkowej 2000 mg/kg we narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne (lub wyjàtkowo 5000 mg/kg) inast´pnie badanie zwyuzwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od pokorzystaniem czterech zwierzàt nara˝anych na subczàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà stancj´ wdawce na tym samym poziomie, spe∏nia si´ one dostarczyç u˝ytecznych informacji. wymagania badania dawki granicznej zgodne zopisanà procedurà. 2. WYNIKI 1.6. Obserwacje Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego poje- zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane dynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierw- powinny byç zebrane wformie tabeli przedstawiajàcej szych 30 minut po podaniu badanej substancji i okre- dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczsowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem b´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, liczszczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Ob- b´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badaserwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie nia, czas padniecia poszczególnych zwierzàt, opis przez 14 dni, zwyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç i czas wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalone usuwane z badania i w sposób humanitarny noÊci reakcji oraz wyniki sekcji. uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç 3. SPRAWOZDANIE okreÊlony przez objawy toksyczne, czas ich rozpocz´- cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce ini dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç od- formacje: powiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikania objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie Badana substancja: w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóênienia objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 11 pi- — stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak- Êmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systema- ˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomerytycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia zacja), osobne zapisy. — dane identyfikacyjne, w tym numer CAS. Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwie- NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne): rz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏o- — uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim nach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym, woda. uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomoto- Badane zwierz´ta: rycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na pojawienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, le- — gatunek/szczep,

— stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany, 2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the — liczba, wiek ip∏eç zwierzàt (wtym tak˝e uzasadnie- testing of substances and preparations for their nie zastosowania samców zamiast samic), acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279—291. — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, 3) Van den Heuvel M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Kopasza itp. undakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international Warunki doÊwiadczenia: validation of the fixed — dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. To- — szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji) xicol., 28, 469—482. badanej substancji, wtym stan skupienia podanego materia∏u, 4) Whithead and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed — dose procedure. Fd. Chem. — szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania Toxicol., 30, 313—324. badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci i czas podawania, 5) Stallard and Whitehead, A.(1995). Reducing the numbers in the fixed — dose procedure. Human — szczegó∏owe dane dotyczàce paszy ijakoÊci wody, Exptl. Toxicol., 14, 315—323. w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody, 6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. — podstawy wyboru dawki poczàtkowej. (2000). Statistical evaluation of modifications to the fixed — dose procedure (manuscript in prepa- Wyniki: ration). — uj´te wtabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia ipozio- 7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Tomu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy tokxicity Testing. Environmental Health and Safety MosycznoÊci ∏àcznie ze ÊmiertelnoÊcià, nasilenie nograph Series on Testing and Assessment N. 24. i czas trwania objawów), Paris. — uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej 8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognizmian, tion, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used — masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podain Safety Evaluation. Environmental Health and wania badanej substancji inast´pnie wodst´pach Safety Monograph Series on Testing and Assetygodniowych oraz wdniu padni´cia bàdê uÊmiersment N. 19. cenia, 9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Clas- — data i czas padni´cia, sification for Human Health and Environmental Ef- — czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i infor- fects of Chemical Substances as endorsed by the macje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwie- 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee rz´cia, and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ — jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ hi- pages/home/displaygeneral/0,3380,ENdocustopatologicznych ka˝dego zwierz´cia. ments-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Dyskusja i interpretacja wyników. 10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Se- Wnioski. gal, L.,Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up—and—Down, Conventional 4. PIÂMIENNICTWO LD50, and Fixed—Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231. 1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the 11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute classification of substances and preparations on Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methe basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, thods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Edi- 85—92. tor. Raven Press, Ltd. New York, USA. SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WSTĘPNEGO dawka początkowa: 5 mg/kg 1 zwierzę 1 zwierzę I zwierzę 1 zwierzę 50 mg/kg 2000 mg/kg Klasyfikuj GHS Kategoria 1* Początek bad. gł. 300 2000 2000 Dawka (mg/kg): dawka początkowa: 50 mg/kg I zwierzę I zwierzę I zwierzę 1 zwierzę 300 mg/kg 2000 mg/kg Początek bad. gł. 300 2000 2000 Dawka (mg/kg): * dla wyniku CA) w 5 mg/kg istnieje procedura uzupełnia- CAD) zgon jąca dla potwierdzenia klasyfikacji GHS: zobacz pkt 1.5.2. CBD toksyczność widoczna Cc) brak widocznej toksyczności i zgonu Nr 251 16370 I zwierzę 5 mg/kg Klasyfikuj GHS Kategoria 1* Dawka (mg/kg): 1 zwierzę 5 mg/kg Klasyfikuj GHS Kategoria 1* Początek bad. gł. Dawka (mg/kg): CB) toksyczność widoczna brak widocznej toksyczności i zgonu SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WSTĘPNEGO 1 zwierzę 50 mg/kg 1 zwierzę 50 mg/kg dawka początkowa: 300 mg/kg I zwierzę I zwierzę 300 mg/kg 2000 mg/kg 300 2000 2000 dawka początkowa: 2000 mg/kg 1 zwierzę I zwierzę 300 mg/kg 2000 mg/kg 2000 2000 * dla wyniku CA) w 5 mg/kg istnieje procedura uzupełniająca dla potwierdzenia klasyfikacji GHS: zobacz pkt 1.5.2. Nr 251 16371 Dawka początkowa: 5 mg/kg 5 zwierząt Klasyfikuj kateg. GHS 5 zwierząt 5 mg/kg SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA WŁAŚCIWEGO 5 zwierząt 5 zwierząt $ zwierząt 50 mg/kg * 300 mg/kg 2000 mg/kg 5/nieklasyfik. Dawka początkowa: 50 mg/kg 5 zwierząt 5 zwierząt 5 zwierząt 300 mg/kg 2000 mg/kg 5/nieklasyfik. Wielkość grupy 5 zwierząt w każdej grupie badania właściwego zawiera każde zwierzę badane w tej dawce w badaniu wstępnym * Przekroczenie dobrostanu zwierząt Jeżeli ta dawka spowodowała śmierć w badaniu wstępnym, to dalsze zwierzęta nie będą badane. Przejdź do CAD Nr 251 16372 5 zwierząt 5 mg/kg Klasyfikuj kateg. GHS 5 zwierząt 5 mg/kg Klasyfikuj kateg. GHS 2 padnięcia > 1 z widoczną toksycznością i/lub 1 zgon Brak widocznej toksyczności i zgonu SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA WŁAŚCIWEGO DAWKA POCZĄTKOWA: 300 mg/kg START 5 zwierząt 5 zwierząt 5 zwierząt 50 mg/kg 300 mg/kg 2000 mg/kg* 5/nieklasyfik. Dawka początkowa: 2000 mg/kg 5 zwierząt 5 zwierząt 5 zwierząt 50 mg/kg 300 mg/kg 2000 mg/kg 5/nieklasyfik. Wielkość grupy 5 zwierząt w każdej grupie badania właściwego zawiera każde zwierzę badane w tej dawce w badaniu wstępnym * Przekroczenie dobrostanu zwierząt Jeżeli ta dawka spowodowała śmierć w badaniu wstępnym, to dalsze zwierzęta nie będą badane. Przejdź do CAD Nr 251 16373

KRYTERIA KLASYFIKACJI KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD PRZEKRA- 50 W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko CZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ brane mo˝e byç zastosowanie najwy˝szej ustalonej daw- Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla ki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej toksycz- 5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowanoÊci ostrej, które w pewnych okolicznoÊciach mogà ne tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodobieƒstanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populacji. Przewidustwo, ˝e wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie je si´, ˝e substancje te wykazujà wartoÊç LD po poda- 50 znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi izwierzàt (zobacz niu do˝o∏àdkowym lub naskórnym wzakresie 2000 do pozycja 9 piÊmiennictwa). 5000 mg/kg lub równowa˝ne dawki poprzez inne drogi nara˝enia. Substancje badane mogà byç zaklasyfiko- Badanie wst´pne wane do klasy zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez: 2000 mg/kg<LD <5000 mg/kg (Kategoria 50 Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane 5 w GHS) w nast´pujàcych przypadkach: w Schemacie 1 sà rozszerzone do poziomu dawki a) je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat 5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje badawczy (Schemat 2) woparciu owyst´powanie si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/l, to wynik A (padni´- ÊmiertelnoÊci, cie) b´dzie wymaga∏ drugiego zwierz´cia do badaƒ w dawce 2000 mg/kg, wyniki B i C (widoczne objawy b) je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà toksycznoÊci lub brak objawów toksycznoÊci) pozwoli ˝e wartoÊç LD b´dzie mieÊci∏a si´ wzakresie Ka- na wybór dawki 5000 mg/kg do badania w∏aÊciwego. 50 tegorii 5; lub inne badania na zwierz´tach lub skut- Podobnie, jeÊli stosuje si´ innà dawk´ poczàtkowà ni˝ ki toksyczne u ludzi wskazujà ostre dzia∏anie na 5000 mg/kg, to wtedy badanie podà˝y do 5000 mg/kg zdrowie ludzkie, w przypadku wyników B lub C w 2000 mg/kg; wynik A b´dzie dyktowa∏ dawk´ 2000 mg/kg do badania c) przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar daw∏aÊciwego, awyniki BiCdawk´ 5000 mg/kg jako ponych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej czàtkowà do badania w∏aÊciwego. klasy nie jest gwarantowane i: — dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujà- Badania w∏aÊciwe ce na znaczàce skutki toksyczne u ludzi lub Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane — nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas bada- w Schemacie 2 sà rozszerzone do poziomu dawki nia a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu dro- 5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje gà pokarmowà, lub si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/kg, to wynik A (≥ 2 padni´cia) b´dzie wymaga∏ drugiej grupy do badaƒ — gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce obw dawce 2000 mg/kg; wynik B (toksycznoÊç widoczna jawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania a˝ i/lub ≤ 1 padni´cie) lub C(brak objawów dzia∏ania tokdo wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegunki, sycznego) spowoduje brak klasyfikacji substancji wenastroszenia sierÊci lub nietypowego wyglàdu d∏ug GHS. Podobnie, jeÊli stosuje si´ dawk´ poczàtkozewn´trznego, lub wà innà ni˝ 5000 mg/kg, to badanie podà˝y do — gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne 5000mg/kg wprzypadku wyniku Cw2000 mg/kg; nainformacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych st´pnie wynik A 5000 mg/kg spowoduje przypisanie ostrych objawów w innych badaniach na zwie- substancji do Kategorii 5 GHS, a wyniki B lub C sporz´tach. wodujà brak klasyfikacji substancji.

:3 TAMEHCS aine˝ordw ogen∏ep od ywoicÊjezrp serko an EU utamehcs gu∏dew ijcakifysalk od kindowezrP — sib.1.B AZCWADAB ADOTEM)awtcinneimÊip 8 ajcyzop zcaboz()SHG(ogenawozinomrahZ umetsyS ogewotaiwÂ

:3 TAMEHCS ogewotaiw aine˝ordw ogen∏ep od ywoicÊjezrp serko an EU utamehcs gu∏dew ijcakifysalk od kindowezrP — sib.1.B AZCWADAB ADOTEM)awtcinneimÊip 8 ajcyzop zcaboz()SHG(ogenawozinomrahZ umetsyS

Za∏àcznik nr 4 B.1.TRIS. TOKSYCZNOÂå OSTRA (PODANIE DROGÑ POKARMOWÑ) — METODA KLAS TOKSYCZNOÂCI OSTREJ 1. METODA cie cz´Êci zwierzàt wcià˝ jest podstawowym kryterium oceny tego badania. Metoda pozwala na wyznaczenie Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- wartoÊci LD tylko wtedy, gdy przynajmniej dwie 50 sanej w Wytycznej OECD nr 423 (2001). dawki powodujà ÊmiertelnoÊç wy˝szà ni˝ 0 % i ni˝- szà ni˝ 100 %. Zastosowanie wczeÊniej ustalonych da- 1.1. Wst´p wek, bez wzgl´du na badanà substancj´, zklasyfikacjà zwiàzanà wy∏àcznie z liczbà zwierzàt znajdujàcych si´ Metoda klas toksycznoÊci ostrej (zobacz pozycja 1 w ró˝nych stanach polepsza zgodnoÊç wyników uzypiÊmiennictwa) jest etapowà procedurà, w której wyskanych w ró˝nych laboratoriach oraz ich powtarzalkorzystuje si´ na ka˝dym etapie 3 zwierz´ta jednej noÊç. p∏ci. W zale˝noÊci od ÊmiertelnoÊci i/lub stanu agonii zwierzàt konieczne mogà byç Êrednio 2—4 etapy dla Przed przystàpieniem do badania wykonujàcy je ustalenia ostrej toksycznoÊci badanej substancji. Propowinien wziàç pod uwag´ wszystkie dost´pne inforcedura ta jest odtwarzalna, wykorzystuje si´ ma∏à macje na temat badanej substancji. Do takich informailoÊç zwierzàt. Umo˝liwia ona uszeregowanie substancji zalicza si´ to˝samoÊç ibudow´ chemicznà substancji w sposób podobny, jak inne metody badania tokcji, jej w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, wyniki innych basycznoÊci ostrej. Metoda klasy toksycznoÊci ostrej daƒ toksykologicznych in vitrolub in vivo, dane toksyopiera si´ na szacunkach biometrycznych (zobacz pokologiczne dla substancji o podobnej budowie chezycje 2, 3, 4 i 5 piÊmiennictwa) w ustalonych, odpomicznej oraz przewidywane zastosowanie(a) tej subwiednio rozdzielonych dawkach tak, aby umo˝liwiç zastancji. Takie informacje sà konieczne w celu przekoszeregowanie substancji do odpowiedniej klasy i ocenania wszystkich zainteresowanych, ˝e badanie jest niç zagro˝enia. Metoda przyj´ta w1996 r. poddana zoodpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odposta∏a procesom walidacji in vivo w stosunku do dawiednie do w∏aÊciwego wyboru dawki poczàtkowej. nych wartoÊci LD uzyskanych zpiÊmiennictwa krajo- 50 wego (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) i mi´dzynaro- 1.2. Definicje dowego (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). ToksycznoÊç ostra po podaniu drogà pokarmowà: Wytyczne, co do wyboru najbardziej w∏aÊciwej oznacza wszystkie szkodliwe skutki, które wyst´pujà metody badawczej s∏u˝àcej temu celowi, podane sà po podaniu substancji drogà pokarmowà w pojedynw Wytycznych ToksycznoÊci Ostrej po Podaniu Drogà czej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie Pokarmowà (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Doku- 24 godzin. ment ten zawiera tak˝e dodatkowe informacje, dotyczàce przeprowadzenia badaƒ iich interpretacji Meto- Zgon opóêniony: oznacza, ˝e zwierz´ nie pada lub dà B.1.tris. nie znajduje si´ wstanie agonii wczasie 48 godzin od podania badanej substancji, ale pada póêniej wczasie Zasadà metody jest, aby nie podawaç substancji 14-dniowego okresu obserwacji. w dawkach, w stosunku do których jest pewnoÊç, ˝e powodujà znaczny ból icierpienie zpowodu ich ostre- Dawka: jest iloÊcià badanej substancji podanej go dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. Zwierz´ta zwierz´ciu. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ badanej subw agonii lub w widoczny sposób cierpiàce bàdê te˝ stancji przypadajàcà na jednostk´ masy cia∏a zwierz´- wykazujàce oznaki silnego i trwa∏ego bólu powinny cia (np. mg/kg). byç w humanitarny sposób uÊmiercone, a w interpretacji wyników powinny zostaç traktowane tak samo GHS: Âwiatowy System Zharmonizowany. Wspóljak zwierz´ta, które pad∏y podczas badania. Kryteria ne przedsi´wzi´cie OECD (zdrowie i Êrodowisko), Kopodj´cia decyzji o uÊmierceniu zwierzàt w agonii lub mitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niecierpiàcych oraz wytyczne co do rozpoznawania przebezpiecznych (w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne), ILO (inwidywanej lub nieuchronnej Êmierci sà przedmiotem formacja o zagro˝eniach) i koordynowane przez Mi´- osobnych Wytycznych (zobacz pozycja 9 piÊmiennicdzyorganizacyjny Program Zarzàdzania Chemikaliami twa). (IOMC). Metoda opiera si´ na zastosowaniu wczeÊniej ustalonych dawek oraz pozwala na uszeregowanie Nieuchronny zgon: oznacza spodziewany stan isklasyfikowanie substancji zgodnie zzasadami Âwia- agonii lub zgon po przed∏u˝eniu czasu obserwacji. Do towego Systemu Zharmonizowanego (GHS) w zakre- objawów mogàcych wskazywaç na taki stan ugryzoni sie klasyfikacji substancji chemicznych powodujàcych zalicza si´ konwulsje, po∏o˝enie boczne, pozycj´ le˝àzatrucie ostre (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). cà idrgawki (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Human Endpoints Guidance Document, zobacz po- Wzasadzie metoda ta nie ma na celu wyznaczania zycja 9 piÊmiennictwa). dok∏adnych wartoÊci LD, ale pozwala na okreÊlenie 50 zdefiniowanych zakresów dawek, w których spodzie- LD (medialna dawka Êmiertelna): jest statystycz- 50 wany jest Êmiertelny skutek zuwagi na fakt, ˝e padni´- nie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spo-

woduje zgon 50 % zwierzàt po podaniu drogà pokar- sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10 mowà. WartoÊç LD jest wyra˝ana w postaci masy piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza otoksykologicznych lub 50 badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie pobadanego zwierz´cia (mg/kg). dobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopodobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe, Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograni- wówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci. czenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg). Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç wyraêne uzasadnienie. Stan agonii: stan umierania lub niezdolnoÊci do prze˝ycia pomimo prowadzenia post´powania leczni- Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe czego (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjwHumane Endpoints Guidance Document, zobacz po- nych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne. zycja 9 pismiennictwa). Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno byç wwieku 8 do 12 tygodni, ajego masa powinna za- Prognozowany zgon: wyst´powanie objawów kli- wieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednicznych Êwiadczàcych o zgonie w przewidywalnym nio nara˝anych zwierzàt. okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem zakoƒczenia do- Êwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia wody lub spo˝y- 1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt wania paszy (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zo- Temperatura wpomieszczeniach doÊwiadczalnych bacz pozycja 9 piÊmiennictwa). powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych od- 1.3. Zasada metody badawczej chyleniach mi´dzy 30 % a70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 go- Zasadà badania zaplanowanego jako etapowe dzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powina byç iwktórym stosuje si´ minimalnà liczb´ zwierzat wpostosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewszczególnym etapach jest otrzymanie wystarczajàcej niç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà informacji o toksycznoÊci ostrej badanej substancji, byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawktóra umo˝liwia klasyfikacj´ tej substancji. Substanki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie mocj´, w iloÊci równej jednej z wybranych dawek, poda- ˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´- je si´ drogà pokarmowà grupie zwierzàt doÊwiadczalcia. nych. Substancj´ bada si´ stopniowo, przy czym na ka˝dym poziomie doÊwiadczenia stosuje si´ 3 zwie- 1.4.3. Przygotowanie zwierzàt rz´ta tej samej p∏ci (zazwyczaj samice). Wystàpienie na którymkolwiek etapie zwiàzanym z nara˝eniem na Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla danà substancj´ skutku Êmiertelnego lub jego brak umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu warunkuje podj´cie dalszych badaƒ, np.: aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzy- — nie ma potrzeby wykonywania dalszych badaƒ, mywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem podawania substancji. — nale˝y podaç t´ samà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwierz´tom, 1.4.4. Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji i ich podawanie — nale˝y podaç nast´pnà wy˝szà lub poprzedzajàcà ni˝szà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwie- Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od rz´tom. dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci poprzez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu. Szczegó∏y procedury opisane sà w Schemacie 1. Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub Metoda pozwala na zaklasyfikowanie badanej sub- mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej stancji do jednej zklas toksycznoÊci okreÊlonych przez badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç ustalone wartoÊci graniczne LD. bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre 50 urz´dy dla nast´pujàcej wdalszej kolejnoÊci oceny ry- 1.4. Opis metody badawczej zyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej 1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç mogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni. 1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztwo- Wbadaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozy- rów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç cja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi 2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to w literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u- w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawane- ˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD, które wykazujà, ˝e go preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie 50 zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej pomi´dzy samcami asamicami gryzoni; awtych przy- kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje padkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice w oleju (np. oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci

roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç Klasyfikacji). Dla dobra zwierzàt odradza si´ badanie znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝ w zakresie Kategorii 5 wg GHS (2000 do 5000 mg/kg). woda. Podawane roztwory muszà byç przygotowane Powinno byç ono brane pod uwag´ tylko wówczas, na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilnoÊç gdy istnieje wysokie prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w jakim takiego badania b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowalna. dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt. 1.5. Sposób post´powania 1.5.3. Badanie dawki granicznej 1.5.1. Podawanie substancji Badanie dawek granicznych wykonywane jest w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiad- Badana substancja jest podawana jednorazowo czenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest wpojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych, gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe wymaganych przez prawo poziomów. Informacje mo˝e byç ona podana wporcjach, przy czym czas po- o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç dania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin. z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarówno pod wzgl´dem sk∏adu jakoÊciowego i iloÊciowego Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji po- produktów. W przypadku braku informacji o toksyczwinny byç g∏odzone (np.: wprzypadku szczurów nale- noÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badany materia∏ jest ˝y g∏odziç je na noc przed badaniem, a w przypadku toksyczny, nale˝y przeprowadziç badanie w∏aÊciwe. myszy nale˝y g∏odziç je na 3—4 godziny przed badaniem). Nie nale˝y wstrzymywaç podawania wody. Po Badanie dawek granicznych mo˝e byç wykonane okresie g∏odzenia zwierz´ta powinny byç zwa˝one, na szeÊciu zwierz´tach (trzy zwierz´ta wka˝dym etapie) anast´pnie nale˝y podaç im badanà substancj´. Po jej przy zastosowaniu jednej dawki 2000 mg/kg masy ciapodaniu paszy nie powinno si´ podawaç zwierz´tom ∏a. Wsytuacjach wyjàtkowych badanie graniczne mo˝e przez 3—4 godziny w przypadku szczurów, a 1—2 go- byç wykonane na trzech zwierz´tach przy u˝yciu subdziny wprzypadku myszy. Gdy badana substancja jest stancji w dawce 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). Jepodawana w kilku porcjach, mo˝e ze wzgl´du na d∏u- ˝eli nara˝enie na badanà substancj´ spowoduje wystàgoÊç okresu nara˝ania okazaç si´ konieczne dostarcze- pienie ÊmiertelnoÊci, to mo˝e okazaç si´ konieczne wynie zwierz´tom paszy i wody w trakcie nara˝ania. konanie dalszego badania dla kolejnej, ni˝szej dawki. 1.5.2. Liczba zwierzàt i poziomy dawek 1.6. Obserwacje W ka˝dym etapie badania stosuje si´ trzy zwierz´- Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego pojeta. Dawka, która ma byç podana jako poczàtkowa, jest dynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierwwybierana zczterech ustalonych poziomów: 5, 50, 300 szych 30 minut po podaniu badanej substancji i okrei 2000 mg/kg masy cia∏a. Dawkà poczàtkowà powinna sowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem byç ta, która w sposób najbardziej prawdopodobny szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obspowoduje ÊmiertelnoÊç u niektórych nara˝anych serwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie zwierzàt. Schemat 1 przedstawia sposób post´powa- przez 14 dni, zwyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç nia dla ka˝dej dawki poczàtkowej. Ponadto Schemat 4 one usuwane z badania i w sposób humanitarny przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug syste- uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie mu UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç GHS. okreÊlony przez reakcje toksyczne, czas ich rozpocz´- cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego Gdy dost´pne dane sugerujà, ˝e ÊmiertelnoÊç i dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç odprawdopodobnie nie wystàpi w najwy˝szej z dawek powiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikapoczàtkowych (2000 mg/kg masy cia∏a), wówczas po- nia objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie winno byç wykonane badanie dla dawek granicznych. w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóê- Gdy dla badanej substancji brak jest jakichkolwiek in- nionych objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 12 piformacji, to dla dobra zwierzàt zaleca si´ stosowanie Êmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systemadawki 300 mg/kg masy cia∏a jako dawki poczàtkowej. tycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia osobne zapisy. Odst´py czasowe pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach sà okreÊlone przez poja- Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwiewienie si´, czas trwania i nasilenie objawów toksycz- rz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y noÊci. Badanie zwierzàt przez nara˝anie na substancj´ obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏ow kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu nach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym, uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio nara- uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym ˝onych zwierzàt. uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomotorycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na poja- Wyjàtkowo i tylko w przypadkach uzasadnionych wienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, lewymaganiami prawnymi mo˝e byç brane pod uwag´ targu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady zastosowanie dawki 5000 mg/kg masy cia∏a (Kryteria i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Do-

cument (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Zwierz´ta Warunki doÊwiadczenia: w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub — szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji) bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercobadanej substancji, wtym stan skupienia podanene. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y go materia∏u, mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia. — szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania 1.6.1. Masa cia∏a badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci i czas podawania, Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawa- — szczegó∏owe dane dotyczàce paszy i jakoÊci wody nia badanej substancji i nast´pnie powinny byç okre- (w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody), Êlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy cia- — podstawy wyboru dawki poczàtkowej. ∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie Wyniki: zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny uÊmierciç. — uj´te wtabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia ipozio- 1.6.2. Badania patologiczne mu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy toksycznoÊci ∏àcznie zÊmiertelnoÊcià, nasilenie iczas Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane bada- trwania skutków), niom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które padnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powo- — uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej dów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie zmian, zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwie- — masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podarz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopowania badanej substancji inast´pnie wodst´pach we narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne tygodniowych oraz wdniu padni´cia bàdê uÊmieruzwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od pocenia, czàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà one dostarczyç u˝ytecznych informacji. — data i czas padni´cia, — czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i infor- 2. WYNIKI macje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwierz´cia, Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane — jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ hipowinny byç zebrane wformie tabeli przedstawiajàcej stopatologicznych ka˝dego zwierz´cia. dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczb´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, licz- Dyskusja i interpretacja wyników. b´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badania, czas zgonu poszczególnych zwierzàt, opis i czas Wnioski. wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalnoÊci reakcji oraz wyniki sekcji. 4. PIÂMIENNICTWO 3. SPRAWOZDANIE 1) Roll et al. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett. Suppl., 31, 86. Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje: 2) Roll et al. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxicitat von Chemikalien. Bundesgesun- Badana substancja: dheitsblatt, 32, 336—341. — stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak- ˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomery- 3) Diener et al. (1994). The biometric Evaluation of zacja), the Acute Toxic Class Method (Orla). Arch. Toxicol., 68, 559—610. — dane identyfikacyjne, w tym numer CAS. 4) Diener et al. (1995). The biometric evaluation of NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne): the OECD modified version of the acute toxic class — uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim method (oral). Arch. Toxicol. 69, 729—734. woda. 5) Diener et al. (1999). Acute toxicity class methods: Badane zwierz´ta: alterations to LD/LC50 tests. ALTEX 16, 129—134. — gatunek/szczep, 6) Schlede et al. (1992). Anational validation study of — stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany, the acute toxicity class method — an alternative to the LD50 test. Arch. Toxicol. 66, 455—470. — liczba, wiek ip∏eç zwierzàt (wtym tak˝e uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic), 7) Schlede et al. (1994). The international validation — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, study of the acute toxicity class method (oral). pasza itp. Arch. Toxicol. 69, 659—670.

8) OECD(2001). Guidance Document on Acute Oral To- SCHEMAT 1 xicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series in Testing and Assessment No 24. PROCEDURA POST¢POWANIA W PRZYPADKU KA˚- Paris. DEJ Z DAWEK POCZÑTKOWYCH 9) OECD (2000). Guidance document on the recogni- UWAGI OGÓLNE tion, assessment and use of clinical signs as human endpoints for experimental animals used in Dla ka˝dej dawki poczàtkowej podj´te powinny safety evaluations. Environmental Health and Sa- byç nast´pujàce post´powania, wed∏ug niniejszego fety Monograph Series in Testing and Assessment Schematu, odpowiednio: No 19. — Schemat 1a: dawkà poczàtkowà jest 5 mg/kg ma- 10) OECD (1998). Harmonized integrated hazard clas- sy cia∏a, sification for human health and environmental ef- — Schemat 1b: dawkà poczàtkowà jest 50 mg/kg mafects of chemical substances. sy cia∏a, 11) Lipnick et al. (1995). Comparison of the up — and — Schemat 1c: dawkà poczàtkowà jest 300 mg/kg — down, conventional LD50 and fixed — dose masy cia∏a, acute toxicity procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231. — Schemat 1d: dawkà poczàtkowà jest 2000 mg/kg masy cia∏a. 12) Chan et al. (1994). Chapter 16, Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxi- W zale˝noÊci od liczby zwierzàt uÊmierconych cology, 3rd ed. A.Hayes editor, Raven Press, Ltd. w sposób humanitarny lub zwierzàt martwych, kolej- New York, USA. ny etap post´powania wskazujà strza∏ki. SCHEMAT 1A: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 5 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1B: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 50 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1C: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 300 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1D: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 2000 MG/KG MASY CIA¸A

KRYTERIA KLASYFIKACJI KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI — gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce ob- ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD PRZEKRA- jawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania 50 a˝ do wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegun- CZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA ki, nastroszenia sierÊci lub niedobrego wyglàdu zewn´trznego, lub Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej — gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne toksycznoÊci ostrej, ale w pewnych okolicznoÊciach informacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych mogà one stanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populaostrych objawów w innych badaniach na zwiecji. Przewiduje si´, ˝e substancje te majà doustne lub rz´tach. skórne LD w zakresie 2000 do 5000 mg/kg lub rów- 50 nowa˝ne dawki poprzez inne drogi nara˝enia. Sub- BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg stancje badane mogà byç zaklasyfikowane do klasy zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez: W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko 2000 mg/kg<LD <5000 mg/kg (Kategoria 5 w GHS) 50 przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ mow nast´pujàcych przypadkach: ˝e byç brane zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawa) je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat ki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki badawczy (Schematy 1a—1d) w oparciu o wyst´- 5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowapowanie ÊmiertelnoÊci, ne tylko gdy istnieje silne prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczeb) je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà, nie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt (zobacz pozy- ˝e LD b´dzie wzakresie Kategorii 5; lub inne ba- 50 cja 10 piÊmiennictwa). dania na zwierz´tach lub skutki toksyczne u ludzi wskazujà ostre dzia∏anie na zdrowie ludzkie, Gdy wymagane jest badanie dawki 5000 mg/kg, prowadzi si´ tylko jeden etap (tj. trzy zwierz´ta b´dà c) przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar dastosowane). Je˝eli pierwsze zadawkowane zwierz´ nych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej padnie, dalsze dawkowanie nast´puje w 2000 mg/kg klasy nie jest gwarantowane i: zgodnie z procedurà wed∏ug Schematu 1. Je˝eli — dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujàpierwsze zwierz´ prze˝yje, to dawkowane sà dwa dalce na znaczàce objawy toksycznoÊci u ludzi lub sze zwierz´ta. Je˝eli tylko jedno ztrzech zwierzàt pad- — nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas bada- nie, to LD prawdopodobnie przekracza 5000 mg/kg. 50 nia a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu dro- Je˝eli zginà dwa osobniki, to dawkowanie przechodzi gà pokarmowà, lub do poziomu 2000 mg/kg.

SCHEMAT 2: METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 2 (kontynuowany): METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 2 (kontynuowany): METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

Za∏àcznik nr 5 B.4. TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA SKÓR¢ 1. METODA ca si´ sposób badania etapowego. Dla substancji istniejàcych o niewystarczajàcych danych dotyczàcych Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ strategi´ t´ sanej w Wytycznej OECD nr 404 (2002). nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub spo- 1.1. Wst´p sobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji oniestosowaniu etapowego sposobu badania musi byç uza- Podczas opracowywania niniejszej metody szcze- sadnione. gólnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia, bioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie Je˝eli za pomocà analizy wagi dowodów nie mo˝- wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych bada- na ustaliç, czy dana substancja posiada w∏aÊciwoÊci nej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na dra˝niàce lub ˝ràce, to wówczas, zgodnie ze strategià zwierz´tach laboratoryjnych. W metodzie tej przed etapowego badania, nale˝y podjàç decyzj´ o przepropodj´ciem badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego ba- wadzeniu badania in vivo (zobacz Schemat). danej substancji na skór´ in vivozaleca si´ wykonanie oceny wagi dowodów istniejàcych danych. Je˝eli sà 1.2. Definicje dost´pne niepe∏ne dane, to mogà byç one uzupe∏nio- Dzia∏anie dra˝niàce na skór´: jest to wywo∏anie ne przez zastosowanie badania sekwencyjnego (zoodwracalnego uszkodzenia skóry wczasie do 4 godzin bacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Strategia badawcza po na∏o˝eniu badanej substancji. zawiera wykonanie zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro, aprzedstawiona jest ona wSchemacie Dzia∏anie ˝ràce na skór´:jest to wywo∏anie nieodza∏àczonym do niniejszej metody. Ponadto zaleca si´, wracalnych uszkodzeƒ skóry; w postaci widocznej je˝eli to w∏aÊciwe, sekwencyjne anie jednoczesne stomartwicy naskórka iskóry wczasie do 4 godzin po nasowanie trzech pól do przeprowadzenia testów p∏atko- ∏o˝eniu badanej substancji. Dzia∏anie ˝ràce charaktewych na zwierz´ciu we wst´pnym badaniu in vivo. ryzuje si´ wrzodami, krwawieniem, krwawymi strupami i na koƒcu 14-dniowego okresu obserwacji odbar- Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe jak wieniem powodowanym ∏uszczeniem si´ skóry, ca∏koidobro zwierzàt, nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo, witym miejscowym wy∏ysieniem oraz bliznami. Dla przed przeprowadzeniem analizy wagi dowodów oceny wàtpliwych uszkodzeƒ nale˝y uwzgl´dniç badawszystkich dost´pnych danych istotnych dla identyfinia histopatologiczne. kacji potencjalnego dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na skór´. Dane takie powinny zawieraç do- 1.3. Zasada metody badawczej wody otrzymane w badaniach wykonanych u ludzi i na zwierz´tach laboratoryjnych, dowody o dzia∏aniu Badanà substancj´ nanosi si´ w pojedynczej daw- ˝ràcym/dra˝niàcym jednej lub wi´cej podobnych ce na skór´ zwierz´cia doÊwiadczalnego; nienara˝ane strukturalnie substancji lub mieszanin takich substan- pola skóry zwierz´cia doÊwiadczalnego s∏u˝à jako cji, dane wskazujàce na silnà kwasowoÊç lub zasado- kontrola. W celu uzyskania ca∏kowitej oceny skutków woÊc substancji (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa), stopieƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego jest odczytywaatak˝e wyniki zwalidowanych iakceptowanych badaƒ ny ipunktowany wustalonych odst´pach czasu, anawykonanych wwarunkach in vitrolub ex vivo(zobacz st´pnie opisywany. Czas trwania badania powinien pozycje 4, 5 i 6 piÊmiennictwa). Taka analiza powinna byç wystarczajàcy dla oceny odwracalnoÊci lub nieodograniczyç potrzeby wykonywania wwarunkach in vi- wracalnoÊci obserwowanych skutków. vo oceny dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w przypadku substancji, dla których ju˝ zebrano wy- Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego starczajàce dowody z innych badaƒ tych dwóch kie- wstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ murunków dzia∏ania toksycznego. szà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏anie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria Zalecana strategia badania etapowego, obejmujà- podj´cia decyzji o humanitarnym uÊmierceniu zwieca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝rà- rzàt w stanie agonii lub silnie cierpiàcych mo˝na znacego za pomocà zwalidowanych iakceptowanych me- leêç w piÊmiennictwie (zobacz pozycja 9 piÊmiennictod in vitrolub ex vivo,jest do∏àczona wformie Sche- twa). matu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody. Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zale- 1.4. Opis metody badawczej cona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz po- 1.4.1. Przygotowanie do badania in vivo zycja 7 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmo- 1.4.1.1. Wybór gatunku badanego nizowanym (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stoprzed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania sowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przydanych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dzia- padku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uza- ∏ania dra˝niàcego/˝ràcego dla nowych substancji zale- sadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierzàt 1.4.2.3. Badanie wst´pne (badanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´, na jednym Oko∏o 24 godziny przed na∏o˝eniem substancji na- zwierz´ciu) le˝y usunàç sierÊç przez krótkie strzy˝enie cz´Êci grzbietowej tu∏owia zwierzàt. Nale˝y zwróciç uwag´, Stanowczo zaleca si´, by badanie in vivo przeproby nie uszkodziç skóry; wbadaniu mogà byç stosowa- wadziç wst´pnie na jednym zwierz´ciu, szczególnie, ne jedynie zwierz´ta ze zdrowà, nienaruszonà skórà. gdy przewiduje si´, ˝e substancja posiada w∏aÊciwo- Êci ˝ràce. Jest to zgodne ze strategià badania etapo- Niektóre odmiany królików posiadajà pola g´stej wego (zobacz Schemat). sierÊci, które uwidaczniajà si´ bardziej w niektórych porach roku. Takich pól zg´stà sierÊcià nie nale˝y wy- Je˝eli na podstawie analizy wagi dowodów ocebieraç jako miejsca do przeprowadzenia badania. niono, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco, nie ma potrzeby przeprowadzenia dalszych badaƒ na zwierz´tach. Dla 1.4.1.3. Warunki przebywania i karmienia zwierzàt wi´kszoÊci substancji podejrzanych o dzia∏anie ˝ràce dalsze badania in vivo na ogó∏ nie sà potrzebne. Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedyn- W przypadkach gdy dodatkowe dane by∏yby konieczczo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym ne, ze wzgl´du na brak dostatecznych dowodów, mo˝- dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç na wykonaç ograniczone badania na zwierz´tach, stowzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszsujàc nast´pujàcy sposób post´powania: nanosi si´ czalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza kolejno do trzech p∏atków na zwierz´. Pierwszy p∏atek wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). usuwa si´ po trzech minutach. Gdy nie obserwuje si´ Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin powa˝nych reakcji na skórze, nanosi si´ drugi p∏atek Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt i usuwa po godzinie. Je˝eli obserwacje na tym etapie powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, wskazujà, ˝e nara˝enie mo˝e byç w sposób humaninale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. tarny przed∏u˝one do czterech godzin, nak∏ada si´ trzeci p∏atek i usuwa go po czterech godzinach, a na- 1.4.2. Sposób post´powania st´pnie ocenia si´ wynik badania. 1.4.2.1. Nanoszenie badanej substancji Je˝eli obserwuje si´ dzia∏anie ˝ràce po którymÊ z tych trzech etapów nara˝enia, doÊwiadczenie nale˝y Badana substancja powinna byç nanoszona na ma∏à powierzchni´ (oko∏o 6 cm2) skóry i przykryta natychmiast zakoƒczyç. Je˝eli nie obserwuje si´ dzia- ∏ania ˝ràcego po usuni´ciu ostatniego p∏atka, zwierz´ p∏atkiem gazy, umocowanym niedra˝niàcà taÊmà. obserwuje si´ przez 14 dni, chyba ˝e dzia∏anie ˝ràce W przypadku gdy nie mo˝na nanosiç substancji bezwystàpi wczeÊniej. poÊrednio (np. ciecz lub niektóre pasty), nale˝y nanieÊç badanà substancj´ najpierw na p∏atek gazy ina- W przypadkach gdy nie przewiduje si´ dzia∏ania st´pnie na∏o˝yç go na skór´. P∏atek wczasie nara˝ania ˝ràcego badanej substancji, lecz dzia∏anie dra˝niàce, powinien byç wswobodnym kontakcie ze skórà za ponak∏ada si´ jeden p∏atek na jedno zwierz´ na cztery mocà odpowiedniego pó∏przepuszczalnego banda˝a. godziny. Gdy badanà substancj´ nanosi si´ na p∏atek, nale˝y go przenieÊç na skór´ w taki sposób, by zapewniç dobry 1.4.2.4. Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania kontakt ze skórà i równomierne rozprowadzenie subdra˝niàcego skór´ in vivo na dodatkowych stancji na skórze. Nale˝y zapobiec, by zwierz´ nie miazwierz´tach) ∏o dost´pu do p∏atka i nie spo˝y∏o go lub nie wdycha- ∏o badanej substancji. Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia- Ciek∏e substancje stosuje si´ z zasady jako nieroz- ∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego cieƒczone. Gdy bada si´ substancje sta∏e (które mogà dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do dwóch dobyç wrazie potrzeby sproszkowane), nale˝y je zwil˝yç datkowych zwierzàt, nak∏adajàc im po jednym p∏atku najmniejszà iloÊcià wody (lub w razie potrzeby innym na cztery godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserodpowiednim noÊnikiem) wystarczajàcà do zapewnie- wowano dzia∏anie dra˝niàce, badanie potwierdzajàce nia dobrego kontaktu ze skórà. Oile stosuje si´ noÊnik powinno si´ przeprowadziç wsposób etapowy lub nainny ni˝ woda, to jego mo˝liwy wp∏yw na dra˝nienie ra˝aç dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W wyskóry przez badanà substancj´ powinien byç minimal- jàtkowym przypadku, gdy nie prowadzi si´ badania ny, a najlepiej gdyby to dzia∏anie nie wystàpi∏o. wst´pnego, na dwa lub trzy zwierz´ta nak∏ada si´ po jednym p∏atku, które usuwa si´ po czterech godzi- Po up∏ywie okresu nara˝enia, w warunkach typo- nach. Gdy u˝ywa si´ dwóch zwierzàt i oba wykazujà wych po 4 godzinach nale˝y usunàç pozosta∏oÊci ba- takà samà reakcj´, nie potrzeba dalszych badaƒ. Windanej substancji, najlepiej u˝ywajàc wody lub odpo- nym przypadku nale˝y badaç równie˝ trzecie zwierz´. wiedniego rozpuszczalnika niezmieniajàcego istniejà- Dla oceny dwuznacznych reakcji potrzebne b´dzie cej reakcji lub integralnoÊci naskórka. u˝ycie dodatkowych zwierzàt. 1.4.2.2. Poziom dawkowania 1.4.2.5. Okres obserwacji Na badane miejsce nak∏ada si´ 0,5 ml cieczy Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy wzgl´dnie 0,5 g substancji sta∏ej lub pasty. do pe∏nej oceny odwracalnoÊci obserwowanych skut-

ków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w momencie, akcje jak ∏ysienie (na ograniczonej powierzchni), nadgdy zwierz´ta wykazujà ciàg∏e oznaki silnego bólu lub mierne rogowacenie, przerosty i z∏uszczenie utrzymuci´˝ki stan. Dla ustalenia odwracalnoÊci skutków zwie- jà si´ do koƒca 14-dniowego okresu obserwacji, to barz´ta nale˝y obserwowaç do 14 dni po usuni´ciu p∏at- danà substancj´ nale˝y uznaç za dra˝niàcà. ków. Gdy odwracalnoÊç widoczna jest przed 14 dniami doÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w tym czasie. 3. SPRAWOZDANIE 1.4.2.6. Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia∏y- 3.1. Sprawozdanie z badaƒ wania na skór´ Sprawozdanie zbadaƒ musi zawieraç nast´pujàce Wszystkie zwierz´ta nale˝y badaç, zwracajàc uwa- informacje: g´ na oznaki rumienia oraz obrz´ku, anast´pnie nale- ˝y oceniç reakcj´ wg skali punktowej po 60 minutach, Racjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia baapóêniej po 24, 48 i72 godzinach po usuni´ciu p∏atka. dania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ, W badaniu wst´pnym na jednym zwierz´ciu nale˝y ∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego: sprawdziç miejsce na∏o˝enia bezpoÊrednio po usuni´- — opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniejciu p∏atka. Reakcje skórne nale˝y oceniç wg skali szych badaƒ, punktowej i odnotowaç zgodnie z tabelà B.4.1. Je˝eli po 72 godzinach uszkodzenie skóry nie mo˝e byç okre- — wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze Êlone jako dzia∏anie dra˝niàce lub ˝ràce, to dla ustale- strategii badania, nia odwracalnoÊci skutków obserwacje nale˝y prowa- — opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro, dziç do 14 dnia. W uzupe∏nieniu obserwacji dzia∏ania ∏àcznie ze szczegó∏ami post´powania, wyniki uzydra˝niàcego nale˝y odnotowaç i dok∏adnie opisaç skane dla badanej substancji kontrolnej, wszystkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak od- — analiz´ przeprowadzenia badania in vivo. t∏uszczenie skóry oraz jakiekolwiek szkodliwe skutki dzia∏ania ogólnego (np. kliniczne objawy toksyczne Badana substancja: iwp∏yw na mas´ cia∏a). Wcelu wyjaÊnienia dwuznacz- — dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o nych reakcji nale˝y rozwa˝yç przeprowadzenie badaƒ otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii), histopatologicznych. — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. Ocena reakcji skóry wg skali punktowej jest z ko- wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa∏oÊç), niecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny — wprzypadku mieszanin, sk∏ad iudzia∏ procentowy reakcji skóry wg skali punktowej i wsparcia laboratosk∏adników. riów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przeprowadzeniu i interpretacji obserwacji, personel przepro- NoÊnik: wadzajàcy je nale˝y odpowiednio przeszkoliç wzakre- — identyfikacja, st´˝enie (je˝eli dotyczy), stosowana sie stosownego systemu punktowania (zobacz tabela obj´toÊç, poni˝ej). Dla stopniowania dzia∏ania dra˝niàcego na skór´ lub innych uszkodzeƒ pomocne mogà byç — uzasadnienie wyboru noÊnika. wszelkie ilustrowane przewodniki (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). DoÊwiadczalne zwierz´ta: — stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przy- 2. WYNIKI padku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albinotyczne, 2.1. Przedstawienie wyników — liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci, W sprawozdaniu koƒcowym z badania wyniki na- — masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadczele˝y zestawiç w formie tabel i powinny one zawieraç nia, po zakoƒczeniu doÊwiadczenia, wszystkie pozycje wymienione w pkt 3.1. — wiek na poczàtku doÊwiadczenia, 2.2. Ocena wyników — êród∏o pozyskania, warunki przebywania, pasza itp. Ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na skór´ nale˝y oce- Warunki prowadzenia doÊwiadczenia: niaç w powiàzaniu z charakterem i nasileniem uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci. — technika przygotowania miejsca nak∏adania, Indywidualna punktacja nie prezentuje bezwzgl´dne- — szczegó∏y dotyczàce materia∏u stosowanego na go standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych substancji, pop∏atki i technika nak∏adania, niewa˝ inne skutki wywo∏ane przez badany materia∏ sà równie˝ brane pod uwag´. Natomiast indywidual- — szczegó∏y przygotowania substancji do badaƒ, nana punktacja powinna byç rozpatrywana jako wartoÊç k∏adanie i usuwanie. odniesienia, którà nale˝y oceniaç w po∏àczeniu Wyniki: z wszystkimi innymi obserwacjami z tego badania. — zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝- W ocenie dzia∏ania dra˝niàcego nale˝y braç pod niàcego/˝ràcego, indywidualnie dla ka˝dego zwieuwag´ odwracalnoÊç uszkodzeƒ skóry. Je˝eli takie re- rz´cia, dla wszystkich okresów obserwacji,

— opis wszystkich obserwowanych uszkodzeƒ, 5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhut- — s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego ter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM interdzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego, jak iwyniki ba- national validation study on in vitro tests for daƒ histopatologicznych, skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, — opis jakichkolwiek innych skutków miejscowych pp. 483—524. (np. odt∏uszczenie skóry) iskutków ogólnoustrojowych towarzyszàcych dzia∏aniu dra˝niàcemu lub 6) Testing Method B. 40 Skin Corrosion. ˝ràcemu. 7) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Dyskusja wyników. Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for 4. PIÂMIENNICTWO Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22—24 January 1996 1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Com- (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). bes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.j., Provan, 8) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Clas- W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, sification System for Human Health and Environ- P. (1995). The Integrated Use of Alternative Appro- mental Effects of Chemical Substancecs, as endoraches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Work- sed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals shop Report 8. ATLA 23, 410—429. Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs /Class 2) Young J.R., How M.J., Walker A.P. and Worth /HCL6.htm). W.M.H. (1988). Classification as corrosive or irritant to skin of preparations containing acidic or al- 9) OECD (2000). Guidance Document on the Recognikaline substances without testing on animals. To- tion, Assessment and Use of Clinical Signs as Huxicology In Vitro, 2, 19—26. mane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health 3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., and Safety Publications. Series on Testing and As- Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch, M. sessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/ (1998). Evaluation of the proposed OECD Testing monos.htm). Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709—720. 10) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). 4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irrita- United States Environmental Protection Agency, tion”, European Chemical Industry, Ecology and Office of Pesticides and Toxic Substances, Wa- Toxicology Centre, Brussels. shington, DC, August 1990. TABELA B.4.1: STOPNIOWANIE REAKCJI SKÓRY Rumieƒ i tworzenie si´ strupów Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 Tworzenie si´ obrz´ku Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 W celu wyjaÊnienia wàtpliwych reakcji mo˝na przeprowadziç badania histopatologiczne.

sprawdzonej iprzyj´tej metodyin vitrolub ex vivo(zo- nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝- bacz etapy: 5 i 6). niàce lub jego brak nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do dwóch dodatkowych zwierzàt, nara˝ajàc je przez czte- ToksycznoÊç skórna (Etap 4). Gdy sprawdzono, ˝e ry godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserwuje si´ substancja chemiczna wykazuje dzia∏anie bardzo tok- dzia∏anie dra˝niàce, to badanie potwierdzajàce prowasyczne wkontakcie ze skórà, to badanie in vivodzia∏a- dzi si´ etapowo lub nara˝ajàc dwa dodatkowe zwienia dra˝niàcego/˝ràcego mo˝e byç niewykonalne, rz´ta równoczeÊnie. gdy˝ nak∏adana iloÊç badanej substancji mo˝e przekroczyç najwy˝szà dawk´ toksycznà i wywo∏aç w kon- PIÂMIENNICTWO sekwencji zgon lub silny ból uzwierzàt. Poza tym, gdy badanie toksycznoÊci ostrej skórnej na królikach albi- 1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final notycznych prowadzone by∏o z granicznà dawkà tok- Report on the OECD Workshop on Harmonization sycznà, wynoszàcà 2000 mg/kg m.c. lub wi´cej, i nie of Validation and Acceptance Criteria for Alternatiobserwowano podra˝nienia skóry lub dzia∏ania ˝ràce- ve Toxicological Test Methods. Held on Solna, go, to nie ma potrzeby dodatkowego badania dzia∏a- Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1. nia dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Oceniajàc wcze- oecd.org/ehs/test/background.htm). Êniej przeprowadzone badanie toksycznoÊci ostrej po naniesieniu na skór´, nale˝y mieç na uwadze szereg 2) OECD (1998). Harmonized Intergrated Hazard ClassiokolicznoÊci. Mogà byç na przyk∏ad podane w spra- fication System for Human Health and Environmenwozdaniu niekompletne informacje o uszkodzeniu tal Effects of Chemical Substances, as endorsed by skóry. DoÊwiadczenia i obserwacje mog∏y byç prze- the 28thJoint Meeting of the Chemicals Committee prowadzone na innym gatunku zwierzàt ni˝ króliki, and Working Party on Chemicals, November 1998 którego wra˝liwoÊç na reakcje mog∏a si´ znacznie ró˝- (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). niç. Mo˝e równie˝ forma badanej substancji, nanoszo- 3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., nej na skór´ zwierz´cia, nie by∏a odpowiednia dla Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch, oszacowania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD (np. rozcieƒczanie substancji w badaniu toksycznoÊci Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, skórnej) (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa). Jednak 709—720. wtakich przypadkach, gdy dobrze zaplanowane iprzeprowadzone badania toksycznoÊci skórnej przeprowa- 4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, dzono na królikach, to negatywne wyniki mogà byç W.M.H. (1998). Classification as Corrosive or Irriprzyj´te jako wystarczajàcy dowód, ˝e substancja nie tant to Skin of Preparations Containing Acidic or dzia∏a ˝ràco lub dra˝niàco. Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19—26. Wyniki z badaƒ in vitro i ex vivo (Etap 5 i 6). Substancje, które wykaza∏y w∏aÊciwoÊci ˝ràce lub silnie 5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996). Anidra˝niàce w badaniu przeprowadzonym sprawdzonà mal, Human and In Vitro Test Methods for Prediciprzyj´tà metodà in vitroiex vivo(zobacz pozycje 6 i7 ting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and HopiÊmiennictwa) przeznaczonà do oszacowania tych ward I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. specyficznych skutków, nie muszà byç badane na Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, zwierz´tach. Mo˝na przypuszczaç, ˝e substancje takie 411—436. b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu in vivo. 6) Testing Method B.40 Skin Corrosion. Badanie in vivo na królikach (Etap 7 i 8). Gdy na 7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, podstawie wagi dowodów podejmuje si´ decyzj´ P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhuto przeprowadzeniu doÊwiadczenia in vivo, to nale˝y ter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM inrozpoczàç od badania wst´pnego, u˝ywajàc jednego ternational validation study on in vitro test for zwierz´cia. Gdy wynik tego doÊwiadczenia wskazuje, skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the ˝e substancja dzia∏a ˝ràco na skór´, to nie nale˝y pro- Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. wadziç dalszego badania. Gdy w badaniu wst´pnym 483—524.

RYSUNEK B.4.1. STRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA SKÓR¢ Nr 251 — 16397 — V 5 |Przeprowadzić badania działania żrącego | Działanie żrące na skórę, sprawdzoną i przyjętą metodą in vitro lub ex vivo Substancja nie działa żrąco lub brak międzynarodowo uznanych metod in vitro/ex vivo badania działania źrącego na skórę V 6 | Przeprowadzić badania działania drażnią- | Działanie drażniące cego na skórę, sprawdzoną i przyjętą metodą in vitro lub ex vivo Substancja nie działa drażniąco lub brak międzynarodowo uznanych metod in vitro lub ex vivo badania działania drażniącego na skórę 7 | Przeprowadzić badanie wstępne in vivo na | Silne uszkodzenie skóry jednym króliku V Brak silnych uszkodzeń V 8 |Przeprowadzić badanie potwierdzające, | Działanie żrące lub drażniąużywając jednego lub dwóch dodatko- | CE wych zwierząt Brak działania żrącego lub drażniącego Można wziąć pod uwagę przed krokiem 2 i 3. Przypuszczalnie substancja działa żrąco in vivo. Nie potrzeba dalszych badań. Przypuszczalnie substancja działa drażniąco in vivo. Nie potrzeba dalszych badań. Uznać, że substancja działa żrąco. Nie potrzeba dalszych badań. Uznać substancję za żrącą lub drażniącą. Nie potrzeba dalszych badań. Uznać, że substancja nie działa żrąco lub nie działa drażniąco. Nie potrzeba dalszych badań.

Za∏àcznik nr 6 B.5. TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA OKO 1. METODA szyç potrzeb´ przeprowadzania badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy (in vivo) dla substancji, Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- dla której istniejà ju˝ wystarczajàce dowody z innych sanej w Wytycznej OECD nr 405 (2002). badaƒ, ˝e posiada takie w∏aÊciwoÊci. W przypadku gdy nie mo˝na okreÊliç potencja∏u dzia∏ania dra˝niàce- 1.1. Wst´p go lub ˝ràcego na oczy za pomocà strategii badania etapowego, pomimo przeprowadzonego badania Podczas opracowywania niniejszej metody szcze- dzia∏ania ˝ràcego i dra˝niàcego na skór´ (in vivo), gólnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia, mo˝na przeprowadziç badanie dzia∏ania dra˝niàcebioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie go/˝ràcego na oczy (in vivo). wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych badanej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na Zalecana strategia badania etapowego, obejmujàzwierz´tach laboratoryjnych. Wmetodzie tej zaleca si´ ca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania ˝ràcego/dra˝nieprzed podj´ciem badania in vivo dzia∏ania dra˝niàce- nia za pomocà zwalidowanych i akceptowanych mego/˝ràcego badanej substancji na oczy wykonanie tod in vitro lub ex vivo jest do∏àczona w formie Scheoceny wagi dowodów istniejàcych danych (zobacz po- matu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody. zycja 1 piÊmiennictwa). Je˝eli sà dost´pne niepe∏ne Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zaledane, to mogà byç one uzupe∏nione przez zastosowa- cona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz ponie badania sekwencyjnego (zobacz pozycje 2 i 3 pi- zycja 9 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana Êmiennictwa). Strategia badawcza zawiera wykonanie strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmozwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro, nizowanym (GHS) (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). aprzedstawiona jest ona wSchemacie za∏àczonym do Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta niniejszej metody. Ponadto, w celu przewidzenia dzia- przed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania ∏ania ˝ràcego na oczy, przed podj´ciem badania in vi- danych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dziavo na oku zaleca si´ wziàç pod uwag´ wyniki badaƒ ∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji dla nowych subin vivo toksycznoÊci ostrej skórnej, dzia∏ania dra˝nià- stancji zaleca si´ sposób badania etapowego. Dla subcego/˝ràcego na skór´. stancji istniejàcych oniewystarczajàcych danych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ stra- Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak tegi´ t´ nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych idobro zwierzàt nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo, danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub a˝ do momentu oceny, w wyniku analizy wagi dowo- sposobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji dów, wszystkich dost´pnych, istotnych danych doty- o niestosowaniu etapowego sposobu badania musi czàcych potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego byç uzasadnione. substancji na oczy. Dane takie powinny zawieraç dowody pochodzàce z istniejàcych badaƒ u ludzi i/lub 1.2. Definicje przeprowadzonych na zwierz´tach laboratoryjnych, dowody na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce jednej lub kilku Dzia∏anie dra˝niàce na oczy: jest to wywo∏ywanie substancji o podobnej strukturze lub mieszanin takich zmian woku po podaniu badanej substancji na przedsubstancji, informacje o silnie kwaÊnym lub zasado- nià powierzchni´ oka, które sà w pe∏ni odwracalne wym odczynie tej substancji (zobacz pozycje 4 i 5 pi- w ciàgu 21 dni od podania. Êmiennictwa) i wyniki zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro lub ex vivo dzia∏ania dra˝niàcego Dzia∏anie ˝ràce na oczy: jest to wywo∏ywanie lub ˝ràcego na skór´ (zobacz pozycje 6 i7 piÊmiennic- uszkodzenia tkanek oka lub powa˝nej fizycznej utraty twa). Analiza ta powinna ograniczyç potrzeb´ badania zdolnoÊci widzenia, po podaniu badanej substancji na dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w teÊcie przednià powierzchni´ oka, które nie sà w pe∏ni odin vivo, dla których istniejà ju˝ wystarczajàce dowody wracalne w ciàgu 21 dni od podania. z innych badaƒ dla tych dwóch typów uszkodzeƒ. Badania te powinny byç prowadzone przed, lub jako wy- 1.3. Zasada metody badawczej nik, analizy wagi dowodów. Badanà substancj´ wprowadza si´ w pojedynczej Dla pewnych substancji taka analiza mo˝e wskazy- dawce do jednego oka zwierz´cia doÊwiadczalnego; waç na potrzeb´ przeprowadzenia badaƒ in vivo po- drugie oko s∏u˝y jako kontrolne. Stopieƒ dzia∏ania tencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na dra˝niàcego/˝ràcego na oczy jest oceniany w skali oczy. We wszystkich takich przypadkach przed podj´- punktowej na podstawie uszkodzeƒ rogówki, t´czówki ciem decyzji o przeprowadzeniu takiego badania pre- ispojówki wustalonych odst´pach czasu. Dla uzyskaferowane jest wykonanie badania dzia∏ania dra˝niàce- nia ca∏kowitej oceny skutków nale˝y równie˝ opisaç go/˝ràcego na skór´ (in vivo) oraz ocena wyników ba- inne skutki w oku i negatywne skutki ogólnoustrojodania zgodnie zmetodà badawczà B.4 (zobacz pozycja we. Czas trwania badania powinien byç wystarczajàcy 8 piÊmiennictwa). Zastosowanie analizy wagi dowo- dla oceny odwracalnoÊci lub nieodwracalnoÊci obserdów i strategii badania etapowego powinno zmniej- wowanych skutków.

Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego dodatkowa grupa, nale˝y u˝yç dwóch królików. Nalewstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ mu- ˝y starannie udokumentowaç warunki przemywania, szà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏a- np. moment przemywania, sk∏ad i temperatura cieczy nie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria s∏u- do przemywania, czas trwania przemywania, obj´toÊç ˝àce do podj´cia decyzji o humanitarnym zabiciu stosowanej cieczy i szybkoÊç przemywania. zwierzàt umierajàcych lub silnie cierpiàcych mo˝na odnaleêç w pozycji piÊmiennictwa 11. 1.4.2.3. Poziom dawkowania 1.4.2.3.1. Badanie cieczy 1.4. Opis metody badawczej Wprzypadku badania cieczy stosuje si´ jà wiloÊci 1.4.1. Przygotowanie do badania in vivo 0,1 ml. Badanej substancji nie nale˝y bezpoÊrednio wprowadzaç do oka za pomocà pulweryzatora. Nale˝y 1.4.1.1. Wybór gatunku zwierzàt jà najpierw przenieÊç do naczynia, a nast´pnie wkropliç do oka w iloÊci 0,1 ml. Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stosowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przy- 1.4.2.3.2. Badanie substancji sta∏ych padku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uzasadnienie. W badaniu substancji w stanie sta∏ym, past i substancji sypkich stosowana iloÊç powinna mieç obj´- 1.4.1.2. Przygotowanie zwierzàt toÊç 0,1 ml lub mas´ nie wi´kszà ni˝ 100 mg. Substancj´ nale˝y rozetrzeç na drobny py∏. Obj´toÊç substan- Oczy ka˝dego zwierz´cia wybranego wst´pnie do cji sta∏ej nale˝y mierzyç po delikatnym jej zag´szczebadania nale˝y sprawdziç 24 godziny przed rozpocz´- niu, np. przez stukanie pojemnikiem. O ile badana ciem doÊwiadczenia. Nie nale˝y u˝ywaç zwierzàt, substancja w postaci sta∏ej nie zostanie wydalona uktórych stwierdza si´ objawy podra˝nienia oczu, waz oka zwierz´cia za pomocà odruchu fizjologicznego dy oczu lub istniejàce wczeÊniej uszkodzenie rogówki. do pierwszego punktu odczytu, tj. jednej godziny po podaniu, oko nale˝y przep∏ukaç fizjologicznym roz- 1.4.1.3. Warunki przetrzymywania ikarmienia zwie-rzàt tworem soli lub wodà destylowanà. Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedyn- 1.4.2.3.3. Badanie aerozoli czo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç Zaleca si´, aby substancje z pojemników zaopawzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopusztrzonych wpulweryzatory oraz zaerozoli zebraç przed czalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wprowadzeniem do oka. Jedyny wyjàtek stanowià wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). substancje znajdujàce si´ w ciÊnieniowych pojemni- Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin kach aerozolowych, które nie mogà byç zbierane ze Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt wzgl´du na odparowanie. W takich przypadkach oko powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y trzymaç otwarte i badanà substancj´ wprowanale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. dziç na przednià cz´Êç oka z odleg∏oÊci 10 cm pojedynczym strzykni´ciem trwajàcym oko∏o jednej se- 1.4.2. Sposób post´powania kundy. Odleg∏oÊç ta mo˝e ulec zmianie w zale˝noÊci od ciÊnienia w pojemniku i jego zawartoÊci. Nale˝y 1.4.2.1. Podawanie badanej substancji zwracaç uwag´, by nie uszkodziç oka p∏ynem zrozpylacza. W stosownych przypadkach mo˝e zajÊç ko- Badanà substancj´ nale˝y umieÊciç w worku spo- niecznoÊç oceny mo˝liwoÊci „mechanicznego” uszkojówkowym jednego oka ka˝dego zwierz´cia po ∏agod- dzenia oka spowodowanego silnym dzia∏aniem strunym odsuni´ciu dolnej powieki od ga∏ki ocznej. Na- mienia. st´pnie powieki nale˝y ∏agodnie przytrzymaç razem przez oko∏o jednà sekund´, by zapobiec stratom mate- Dawk´ aerozolu mo˝na ustaliç, symulujàc doria∏u. Drugie oko, które pozostaje nienara˝one, s∏u˝y Êwiadczenie wnast´pujàcy sposób: substancj´ rozpyjako kontrolne. la si´ na zwa˝ony papier wielkoÊci oka królika. Przyrost masy papieru odpowiada w przybli˝eniu iloÊci, 1.4.2.2. Przep∏ukiwanie która zosta∏a wprowadzona do oka. Dla substancji lotnych dawk´ mo˝na ustaliç na podstawie masy pojem- Oczu zwierzàt doÊwiadczalnych nie nale˝y przemy- nika przed i po u˝yciu. waç przez 24 godziny po wprowadzeniu badanej substancji, z wyjàtkiem substancji sta∏ych (patrz 1.4.2.4. Badanie wst´pne (badanie dzia∏ania dra˝niàpkt 1.4.2.3.2) i w przypadku bezpoÊredniego dzia∏ania cego/˝ràcego na oczy in vivo na jednym zwie- ˝ràcego lub dra˝niàcego. Po 24 godzinach mo˝na sto- rz´ciu) sowaç przemycie, jeÊli jest to potrzebne. Jak przedstawiono wstrategii badania sekwencyj- Nie zaleca si´ stosowania dodatkowej grupy zwie- nego (zobacz Schemat 1) stanowczo zaleca si´, by barzàt celem zbadania wp∏ywu przemywania, dopóki nie danie in vivo przeprowadziç wst´pnie na jednym jest to naukowo umotywowane. Gdy potrzebna jest zwierz´ciu.

O ile wyniki tego badania po zastosowaniu opisa- dzenia: perforacja rogówki lub znaczàce owrzodzenie nej procedury wskazujà, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco lub rogówki ∏àcznie zgarbiakiem rogówki, krew wprzedsilnie dra˝niàco na oczy, to nie nale˝y przeprowadzaç niej komorze oka, 4 stopieƒ nieprzezroczystoÊci rodalszych badaƒ dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego na gówki utrzymujàcej si´ przez 48 godzin, brak reakcji oczy. na Êwiat∏o (2 stopieƒ reakcji t´czówki), utrzymujàce si´ przez 72 godziny, owrzodzenie b∏on spojówko- 1.4.2.5. Miejscowe znieczulenie wych, martwica b∏on spojówkowych lub mru˝nych lub linienie. Tego typu uszkodzenia sà zazwyczaj nie- Miejscowe znieczulenie nale˝y stosowaç w okre- odwracalne. Êlonych przypadkach. Je˝eli analiza wagi dowodów wskazuje, ˝e substancja mo˝e wywo∏aç ból, lub Zwierz´ta niewykazujàce uszkodzeƒ oka nale˝y zawst´pne badanie pokazuje, ˝e nast´puje reakcja bólo- bijaç nie wczeÊniej ni˝ przed up∏ywem 3 dni po wprowa, to nale˝y przed wprowadzeniem badanej sub- wadzeniu substancji. Zwierz´ta wykazujàce ∏agodne stancji zastosowaç miejscowe znieczulenie. Nale˝y lub umiarkowane uszkodzenia nale˝y obserwowaç, starannie dobraç rodzaj, st´˝enie i dawk´ substancji dopóki zmiany si´ nie ustabilizujà lub przez 21 dni, znieczulajàcej tak, aby zapewniç, ˝e jej zastosowanie apo tym czasie zakoƒczyç doÊwiadczenie. Obserwacje nie wywo∏a znaczàcych ró˝nic w reakcji badanej sub- nale˝y przeprowadzaç w 7, 14 i 21 dniu celem ustalestancji. W ten sam sposób nale˝y znieczuliç oko kon- nia stanu uszkodzeƒ iich odwracalnoÊci lub braku odtrolne. wracalnoÊci. 1.4.2.6. Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania Stopnie uszkodzenia oka (rogówki, t´czówki i spodra˝niàcego na oczy in vivo na dodatkowych jówki) nale˝y zapisywaç podczas ka˝dego badania (Tazwierz´tach) bela B.5.1). Nale˝y równie˝ zapisywaç wszystkie inne uszkodzenia oka (np. ∏uszczka, zabarwienie) lub szko- Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia- dliwe skutki ogólnoustrojowe. ∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc wdalszych ba- Badanie reakcji mo˝na u∏atwiç, u˝ywajàc lupy bindaniach do dwóch dodatkowych zwierzàt. Gdy w ba- okularowej, r´cznej lampy szczelinowej, biomikroskodaniu wst´pnym obserwowano silne dzia∏anie dra˝- pu lub innych odpowiednich przyrzàdów. Po zapisaniu niàce, wskazujàce na mo˝liwy silny (nieodwracalny) obserwacji po 24 godzinach oczy mo˝na dalej badaç skutek w badaniu potwierdzajàcym, zaleca si´, by ba- przy pomocy fluoresceiny. danie potwierdzajàce prowadziç w sposób etapowy, ka˝dorazowo raczej na jednym zwierz´ciu, ni˝ nara˝aç Ocena reakcji oczu wg skali punktowej jest z kodwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W przypad- niecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny ku gdy u drugiego zwierz´cia wyst´pujà skutki dzia∏a- reakcji oczu wg skali punktowej i wsparcia laboratonia ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego, to doÊwiadczenia riów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przepronie nale˝y kontynuowaç. W celu potwierdzenia s∏a- wadzeniu i interpretacji obserwacji, personel je przebych lub umiarkowanych objawów dzia∏ania dra˝nià- prowadzajàcy nale˝y odpowiednio przeszkoliç w zacego potrzebne b´dà dodatkowe zwierz´ta. kresie odpowiedniego systemu punktowania. 1.4.2.7. Okres obserwacji 2. WYNIKI Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy 2.1. Ocena wyników do pe∏nej oceny wielkoÊci i odwracalnoÊci obserwowanych skutków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç Punktowà ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na oczy naw ka˝dym momencie, gdy zwierz´ta wykazujà oznaki le˝y oceniaç wpowiàzaniu zcharakterem inasileniem silnego bólu lub ci´˝ki stan 9). Dla ustalenia odwracal- uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci skutków zwierz´ta nale˝y obserwowaç do 21 dni noÊci. Indywidualna punktacja nie prezentuje bezod podania substancji. Gdy odwracalnoÊç widoczna wzgl´dnego standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych subjest przed up∏ywem 21 dnia, doÊwiadczenie nale˝y za- stancji. Nale˝y równie˝ oceniç inne skutki wywo∏ane koƒczyç w tym czasie. przez badany materia∏. Natomiast indywidualnà punktacj´ nale˝y uwa˝aç jako wartoÊç odniesienia ima ona 1.4.2.7.1.Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia- tylko wtedy znaczenie, gdy jest poparta pe∏nym opi- ∏ywania na oko sem i ocenà wszystkich obserwacji. Oczy powinny zostaç zbadane po up∏ywie 1, 24, 3. SPRAWOZDANIE 48 i 72 godzin po podaniu substancji. Zaraz po uzyskaniu rozstrzygajàcej informacji uczestnictwo zwie- 3.1. Sprawozdanie z badaƒ rzàt w badaniu powinno trwaç nie d∏u˝ej ni˝ jest to konieczne. Zwierz´ta objawiajàce ciàg∏y silny ból lub Sprawozdanie zbadaƒ musi zawieraç nast´pujàce ci´˝ki stan powinny byç bezzw∏ocznie w sposób hu- informacje: manitarny uÊmiercone, a substancja odpowiednio oceniona. Zwierz´ta nale˝y w sposób humanitarny Racjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia bauÊmierciç, je˝eli po wprowadzeniu badanej substan- dania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ, cji do oka wystàpià nast´pujàce rodzaje jego uszko- ∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego:

— opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniej- — s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego szych badaƒ, dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego, — wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze — opis jakichkolwiek innych uszkodzeƒ obserwowastrategii badania, nych w oku (np. unaczynienie, tworzenie si´ ∏uszczki, zrosty, zabarwienia), — opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro, ∏àcznie z szczegó∏ami post´powania, wyniki uzy- — opis miejscowych i uk∏adowych skutków szkodliskane dla badanej substancji/referencyjnej, wych innych ni˝ zwiàzane zokiem izmian histopatologicznych, o ile wystàpi∏y. — opis przeprowadzonego badania dzia∏ania dra˝- niàcego/˝ràcego na skór´ ∏àcznie z otrzymanymi Dyskusja wyników. wynikami, — analiza wagi dowodów dla przeprowadzonego do- 3.2. Interpretacja wyników Êwiadczenia in vivo. Ekstrapolacja wyników z badania dzia∏ania dra˝- Badana substancja: niàcego na oczy u zwierzàt laboratoryjnych na cz∏owieka jest mo˝liwa tylko w ograniczonym stopniu. — dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o W wielu przypadkach królik albinotyczny jest bardziej otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii), wra˝liwy na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oczy od cz∏owieka. — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa- Podczas interpretacji wyników nale˝y zwróciç ∏oÊç), uwag´, by wykluczyç wyniki dzia∏ania dra˝niàcego spowodowanego wtórnà infekcjà. — w przypadku mieszanin sk∏ad i udzia∏ procentowy sk∏adników, 4. PIÂMIENNICTWO — je˝eli stosowano miejscowe znieczulenie, to˝sa- 1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., CommoÊç Êrodka, zanieczyszczenia, typ, dawka i pobes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., tencjalne wspó∏dzia∏anie z badanà substancjà. Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.j., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, NoÊnik: P. (1995). The Integrated Use of Alternative Appro- — identyfikacja, st´˝enie (o ile dotyczy), stosowana aches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workobj´toÊç, shop Report 8. ATLA 23, 410—429. — uzasadnienie wyboru noÊnika. 2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Ger- Zwierz´ta doÊwiadczalne: ner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential: — stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przy- Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Fopadku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albi- od Chem. Toxicol 35, 159—164. notyczne, 3) Worth, A.P. and Fentem, J.H. (1999). A general ap- — wiek ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadcze- proach for evaluating stepwise testing strategies. nia, ATLA 27, 161—177. — liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci w grupach nara˝anych 4) Young J.R., How M.J., Walker A.P. Worth W.M.H. i kontrolnych (o ile potrzebne), (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline — masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku i po zakoƒ- Substances Without Testing on Animals. Toxicol. czeniu doÊwiadczenia, In Vitro, 2, 19—26. — êród∏o pozyskania zwierzàt, warunki przebywania, 5) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the pasza itp. Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, Wyniki: 227—231. — opis metody stosowanej do oceny dzia∏ania dra˝- 6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, niàcego w ka˝dym czasie obserwacji (np. u˝ycie P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutr´cznej lampy szczelinowej, biomikroskopu, flu- ter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM interoresceiny), national validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the — zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝- Management Team. Toxicology in vitro 12, niàcego/˝ràcego dla ka˝dego zwierz´cia zka˝dego pp. 483—524. czasu obserwacji, a˝ do usuni´cia zwierz´cia zdo- Êwiadczenia, 7) Testing Method B. 40 Skin Corrosion.

8) Testing Method B.4. Acute toxicity: Dermal Irrita- as endorsed by the 28thJoint Meeting of the Chetion/Corrosion. micals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ 9) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: ehs /Class/HCL6.htm). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for 11) OECD (2000). Guidance Document on the Recogni- Alternative Toxicological Test Methods. Held tion, Assessment and Use of Clinical Signs as Huin Solna, Sweden, 22—24 January 1996 mane Endpoints for Experimental Animals Used (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). in Safety Evaluation. OECD Environmental Health 10) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard and Safety Publications. Series on Testing and As- Classification System for Human Health and sessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/ Environmental Effects of Chemical Substancecs, monos.htm). TABELA B.5.1: STOPNIOWANIE USZKODZENIA OKA Rogówka Zm´tnienie: stopieƒ g´stoÊci (odczytuje si´ na obszarze najwi´kszego nasilenia)*) Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 * Nale˝y zapisaç wielkoÊç pola zm´tnienia rogówki. T´czówka

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 3 Obrz´k spojówki Obrz´k (odnosi si´ do powieki i/lub b∏on mru˝nych) Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4

SCHEMAT Strategia etapowego badania dzia∏ania dra˝niàcego przypadkach (zobacz pozycje 3 i 4 piÊmiennictwa). i ˝ràcego na oczy OPIS ETAPOWEJ STRATEGII BADAWCZEJ ROZWA˚ANIA OGÓLNE Przed rozpocz´ciem doÊwiadczeƒ jako cz´Êci strategii badania etapowego (Rysunek B.5.1) nale˝y oce- Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak niç wszystkie dost´pne informacje, dla okreÊlenia poi dobro zwierzàt, wa˝ne jest, by unikaç niepotrzebnetrzeby badania oka in vivo. Chocia˝ istotne informacje go stosowania zwierzàt izmniejszaç liczb´ badaƒ, któmo˝na uzyskaç z oceny pojedynczych parametrów re mog∏yby wywo∏aç silne reakcje u zwierzàt. Przed (np. skrajne wartoÊci pH), nale˝y oceniç ca∏oÊç istniebadaniem in vivo nale˝y oceniç wszystkie istotne injàcych informacji. Nale˝y oceniç na podstawie analizy formacje o substancji dotyczàce jej w∏aÊciwoÊci ˝ràwagi dowodów wszystkie znaczàce dane o skutkach cych i dra˝niàcych na oczy. Byç mo˝e istniejà ju˝ wydzia∏ania substancji lub jej analogów strukturalnych starczajàce dowody do klasyfikacji badanej substancji iprzedstawiç uzasadnienie decyzji. G∏ówny nacisk napod kàtem jej mo˝liwego dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràle˝y po∏o˝yç na istniejàce dane o substancji uzyskane cego na oczy, bez potrzeby prowadzenia doÊwiadczeƒ dla ludzi izwierzàt, anast´pnie wyniki zbadaƒ in vitro na zwierz´tach laboratoryjnych. Dlatego stosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego lub ex vivo. Nale˝y unikaç w miar´ mo˝liwoÊci badaƒ zminimalizuje potrzeb´ badania in vivo, szczególnie dzia∏ania ˝ràcego substancji in vivo. Czynniki brane gdy substancja prawdopodobnie spowoduje silnà re- pod uwag´ w strategii badania obejmujà: akcj´. Ocena istniejàcych danych dotyczàcych dzia∏ania W celu zdecydowania o potrzebie przeprowadze- substancji na ludzi i zwierz´ta (Etap 1). W pierwszej nia dodatkowego badania innego ni˝ badania oczu in kolejnoÊci nale˝y braç po uwag´ istniejàce dane dla vivo, by móc scharakteryzowaç takie dzia∏ania, zaleca ludzi, np. badania kliniczne lub zawodowe i sprawozsi´ stosowanie analizy wagi dowodów na podstawie dania z wypadków i/lub dane z badaƒ przeprowadzoistniejàcych informacji dotyczàcych dzia∏ania dra˝nià- nych na zwierz´tach, gdy˝ dostarczajà one bezpoÊredcego i ˝ràcego substancji na oczy. Gdy sà potrzebne nich informacji o oddzia∏ywaniu na oczy. Nast´pnie dalsze badania, zaleca si´ stosowanie strategii bada- nale˝y oceniç dost´pne dane zbadaƒ na ludziach i/lub nia etapowego dla uzyskania istotnych wyników do- zwierz´tach dotyczàce dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego Êwiadczalnych. Dla substancji, które nie by∏y dotàd na skór´. Substancje o znanym silnym dzia∏aniu dra˝- badane, nale˝y stosowaç strategi´ etapowego badaniàcym lub ˝ràcym na oczy, jak równie˝ substancje nia dla uzyskania zestawu wyników potrzebnych do wykazujàce dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skóoceny si∏y dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oko. Strar´ nie powinny byç wkraplane do oka zwierz´cia; takie tegi´ badania opisanà w niniejszym Schemacie wysubstancje nale˝y uznaç za ˝ràce lub dra˝niàce rówpracowano na warsztatach OECD (zobacz pozycja 1 pinie˝ na oczy. Nie nale˝y badaç w teÊcie in vivo sub- Êmiennictwa). By∏a ona póêniej zatwierdzona i rozwistancji o znanym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym ni´ta w Zharmonizowanym Integralnym Systemie i substancji, co do których istniejà bezsporne dowody Klasyfikacji Ryzyka Skutków Zdrowotnych dla ludzi o braku ich dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. i dla Êrodowiska wywo∏anego przez substancje chemiczne, zaaprobowanego na 28 Wspólnym Posiedze- Analiza zale˝noÊci aktywnoÊci od struktury subniu Komitetu Substancji Chemicznych i Grupy Robostancji (SAR)(Etap 2).Je˝eli dost´pne sà wyniki badaƒ czej d/s Substancji Chemicznych w listopadzie 1998 r. substancji o podobnej strukturze, to nale˝y je wziàç (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa). pod uwag´. Je˝eli dost´pna jest dostateczna liczba Mimo ˝e strategia badania etapowego nie stanowi wyników dotyczàcych substancji opodobnej budowie integralnej cz´Êci metody badawczej B.5, to wyra˝a lub mieszanin takich substancji wskazujàcych na ich zalecany sposób ustalania dzia∏ania dra˝niàcego/˝rà- mo˝liwoÊci dzia∏ania ˝ràcego/dra˝niàcego na oczy docego na oczy. To podejÊcie przedstawia zarówno naj- tyczàcych dzia∏ania na ludzi i/lub zwierz´ta, to mo˝na lepszà praktyk´, jak i etyczny wyznacznik dla badaƒ za∏o˝yç, ˝e oceniana substancja b´dzie wywo∏ywa∏a te dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy in vivo. Metoda same reakcje. W takich przypadkach nie ma potrzeby badawcza dostarcza wskazówek, jak prowadziç do- badania substancji. Wyniki negatywne z badaƒ sub- Êwiadczenie in vivoipodsumowuje czynniki, które po- stancji opodobnej budowie lub mieszanin takich subwinny byç wykorzystane przed rozpocz´ciem takiego stancji nie stanowià wystarczajàcych dowodów na badania. Strategia badania etapowego dostarcza na brak dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w strapodstawie wagi dowodów sposób na ocen´ istniejà- tegii etapowego badania. Sprawdzone i przyj´te spocych danych o w∏aÊciwoÊciach dra˝niàcych/˝ràcych soby z zastosowaniem analizy SAR mogà byç stosobadanej substancji na oczy i zró˝nicowany sposób wane do identyfikacji potencja∏u zarówno dzia∏ania uzyskiwania znaczàcych danych o substancjach, dla ˝ràcego jak i dra˝niàcego na oczy. których potrzebne sà dodatkowe badania lub dla których nie przeprowadzono badaƒ. Strategia obejmuje W∏aÊciwoÊci fizykochemiczne i reaktywnoÊç cheprzeprowadzenie najpierw sprawdzonymi iprzyj´tymi miczna (Etap 3). Substancje wykazujàce skrajne warmetodami in vitrolub ex vivobadaƒ dzia∏ania dra˝nià- toÊci pH, takie jak ≤2,0 i≥11,5, mogà wykazywaç silne cego/˝ràcego, anast´pnie metodà badawczà B.4 dzia- dzia∏anie miejscowe. Je˝eli skrajne wartoÊci pH sà ∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w okreÊlonych podstawà do zaklasyfikowania substancji jako ˝ràcej

wstosunku do skóry, to nale˝y braç równie˝ pod uwa- Badanie in vivo na królikach (Etap 8 i 9). Badanie g´ jej rezerw´ kwasowà/zasadowà (pojemnoÊç bufo- oka in vivo nale˝y rozpoczàç od badania wst´pnego, rowà) (zobacz pozycje 5 i 6 piÊmiennictwa). Je˝eli u˝ywajàc jednego królika. O ile wyniki tego badania zpojemnoÊci buforowej wynika, ˝e substancja nie po- wska˝à, ˝e substancja dzia∏a silnie dra˝niàco lub ˝ràco winna dzia∏aç ˝ràco na oczy, to nale˝y podjàç dalsze na oczy, nie nale˝y przeprowadziç dalszego badania. badania dla potwierdzenia tego, najlepiej przy u˝yciu Je˝eli wbadaniu tym nie wystàpià skutki dzia∏ania ˝ràsprawdzonej iprzyj´tej metody in vitrolub ex vivo(zo- cego lub silnie dra˝niàcego, nale˝y przeprowadziç babacz etapy: 5 i 6). danie sprawdzajàce na dwóch dalszych zwierz´tach. Uwzgl´dnianie innych istniejàcych informacji (Etap PIÂMIENNICTWO 4).Na tym etapie nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje o toksycznoÊci ogólnoustrojowej w nara˝e- 1) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: niu przez skór´. Nale˝y równie˝ oceniç toksycznoÊç Final Report on the OECD Workshop on Harmoniostrà po naniesieniu na skór´ badanej substancji. Oile zation of Validation and Acceptance Criteria badana substancja okaza∏a si´ wysoce toksyczna po for Alternative Toxicological Test Methods. Held podaniu na skór´, nie ma potrzeby badania jej na on Solna, Sweden, 22—24 January 1996 oczach. Chocia˝ zale˝noÊç pomi´dzy toksycznoÊcià (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). ostrà skórnà a dzia∏aniem ˝ràcym/dra˝niàcym na oczy niekoniecznie musi istnieç, to mo˝na przypuÊciç, ˝e 2) OECD (1998). Harmonized Intergrated Hazard Clasgdy jakaÊ substancja jest wysoce toksyczna poprzez sification System for Human Health and Environskór´, wywo∏a równie˝ wysokà toksycznoÊç po wpro- mental Effects of Chemical Substances, as endorwadzeniu do oka. Takie dane powinny byç brane rów- sed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals nie˝ pod uwag´ pomi´dzy etapem 2 i3. Committee and Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ Wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo (Etap 5 i 6). HCL6.htm). Substancje, które wykaza∏y w badaniu przeprowadzonym metodà in vitro lub ex vivo (zobacz pozycje 7 i 8 3) Worth, A.P. and Fentem, J.H. (1999). AGeneral AppiÊmiennictwa), która by∏a sprawdzona i przyj´ta do proach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. szacowania szczególnie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego ATLA 27, 161—177. na oczy lub skór´, dzia∏ania silnie dra˝niàce lub ˝ràce 4) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritanie muszà byç badana na zwierz´tach. Mo˝na przytion/Corrosion. puszczaç, ˝e substancje takie b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu in vivo. Gdy sprawdzo- 5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, ne i przyj´te metody in vitro/ex vivo sà niedost´pne, W.M.H. (1998). Classification as Corrosive or Irrinale˝y ominàç etapy 5 i 6 oraz przejÊç wprost do etatant to Skin of Preparations Containing Acidic or pu 7. Alkaline Substances Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19—26. Oszacowanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego substancji na skór´ (Etap 7). Gdy istniejàce do- 6) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye wody nie stanowià wystarczajàcej podstawy do prze- Irritation Potential of Solutions Prepared at prowadzenia rozstrzygajàcej analizy wagi dowodów a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, o potencjalnym dzia∏aniu ˝ràcym/dra˝niàcym na oczy 227—231. przez danà substancj´ na bazie danych z badaƒ wyszczególnionych powy˝ej, nale˝y najpierw oceniç po- 7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, tencjalne dzia∏anie ˝ràce/dra˝niàce po naniesieniu na P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutskór´ in vivo, stosujàc metod´ badawczà B.4 (zobacz ter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM pozycja 4 piÊmiennictwa) i za∏àczony do niej Schemat international validation study on in vitro test for (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). O ile substancja skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the wyka˝e dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skór´, Management Team. Toxicology in vitro 12, nale˝y przyjàç, ˝e dzia∏a ˝ràco na oczy, chyba ˝e inne pp. 483—524. informacje sk∏onià do innego wniosku. Tak wi´c nie ma potrzeby przeprowadzenia badania oka in vivo. 8) Testing Method B.40 Skin Corrosion. Oile substancja nie wykazuje dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego na skór´ nale˝y przeprowadziç bada- 9) Annex to testing Method B.4.: ASequential Testing nie oka in vivo. Strategy for Skin Irritation and Corrosion.

Rysunek B.5.1. STRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA OCZY

Zarodek: wczesna faza rozwojowa organizmu, woju przedporodowym. Zalecanym gatunkiem wÊród w szczególnoÊci rozwijajàcy si´ produkt zap∏odnienia gryzoni jest szczur, a z pozosta∏ych zwierzàt królik. jaja po pojawieniu si´ osi pod∏u˝nej, a˝ do pojawienia W przypadku, u˝ycia innego gatunku zwierz´cia nalesi´ wszystkich g∏ównych struktur. ˝y podaç uzasadnienie. EmbriotoksycznoÊç: szkodliwe dzia∏anie dla nor- 1.5.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt malnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotnoÊci zarodka. Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C dla gryzoni P∏ód: nienarodzone potomstwo w okresie poza- i 18±3°C dla królików. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna rodkowym. wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas ToksycznoÊç p∏odowa: szkodliwe dzia∏anie dla czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne normalnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotno- oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Êci p∏odu. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograni- Poronienie: przedwczesne wydalenie z macicy czony dost´p do wody. produktu zap∏odnienia: zarodka lub p∏odu niezdolnego do ˝ycia. Kojarzenie w pary powinno byç przeprowadzone w klatkach odpowiednich do tych celów. Preferowane Resorpcja: zarodek, który po zagnie˝d˝eniu w ma- jest przetrzymywanie pojedynczych osobników, ale cicy obumar∏ i jest lub zosta∏ wch∏oni´ty: dopuszczalne jest tak˝e przetrzymywanie osobników w ma∏ych grupach. Resorpcja wczesna: dowód zagnie˝d˝enia bez rozpoznawalnego zarodka/p∏odu. 1.5.3. Przygotowanie zwierzàt Resorpcja póêna: martwy zarodek lub p∏ód Powinny byç stosowane zdrowe zwierz´ta, aklimaz zewn´trznymi zmianami zwyrodnieniowymi. tyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków laboratoryjnych i nieu˝ywane wczeÊniej w innych do- NOAEL:skrót dla poziomu dawkowania bez obser- Êwiadczeniach. Powinny byç znane: rasa, êród∏a powowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy po- chodzenia, p∏eç, waga i/lub wiek zwierzàt. Zwierz´ta ziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodli- wszystkich grup badanych powinny byç, na ile to mo˝- wych skutków zwiàzanych z nara˝eniem. liwe, wtym samym wieku imieç takà samà mas´ cia- ∏a. Na ka˝dym poziomie dawkowania stosuje si´ m∏o- 1.3. Substancja kontrolna de doros∏e dziewicze samice. Samice powinny byç kojarzone z samcami tego samego gatunku i rasy, nale- Brak. ˝y unikaç kojarzenia osobników spokrewnionych. W przypadku gryzoni zerowym dniem cià˝y jest ten, 1.4. Zasada metody badawczej wktórym zaobserwuje si´ czop pochwowy i/lub nasienie; wprzypadku królików dniem zerowym jest zazwy- Badana substancja podawana jest zwierz´tom b´- czaj dzieƒ pokrycia lub sztucznej inseminacji, je˝eli tadàcym wcià˝y przynajmniej od momentu zagnie˝d˝e- ka technika jest stosowana. Klatki nale˝y ustawiç wtania do jednego dnia przed planowanym uÊmierce- ki sposób, by zminimalizowaç mo˝liwy wp∏yw ich niem, które powinno nastàpiç, w miar´ mo˝liwoÊci, ustawienia na wyniki badania. Ka˝demu zwierz´ciu jak najbli˝ej dnia normalnego porodu, bez ryzykowa- nale˝y przypisaç jego w∏asny numer identyfikacyjny. nia utraty danych wynikajàcych z porodu przedwcze- Samice powinny byç przypisane do grupy kontrolnej snego. Niniejsza metoda badawcza nie jest przezna- igrup nara˝anych wsposób losowy. Je˝eli samice byczona, w celu badania jedynie okresu organogenezy ∏y kojarzone grupowo, to zwierz´ta z ka˝dej partii po- (np.: 5—15 dzieƒ ugryzoni i6—18 dzieƒ ukrólika), ale winny zostaç równomiernie rozdzielone pomi´dzy tak˝e w przypadku gdy to w∏aÊciwe, równie˝ skutków grupy. Podobnie samice inseminowane przez tego sanara˝enia z okresu przed zagnie˝d˝eniem przez ca∏y mego samca powinny byç równomiernie rozdzielone okres cià˝y, a˝ do dnia przed ci´ciem cesarskim. Tu˝ pomi´dzy grupy. przed cesarskim ci´ciem samice sà uÊmiercane, zawartoÊç macicy przebadana, a p∏ody ocenione pod 1.6. Sposób post´powania wzgl´dem widocznych zmian zewn´trznych, szkieletowych oraz w tkankach mi´kkich. 1.6.1. Liczba i p∏eç zwierzàt 1.5. Opis metody badawczej Ka˝da grupa kontrolna ibadana powinna zawieraç wystarczajàcà liczb´ samic, by uzyskaç w przybli˝eniu 1.5.1. Wybór gatunku zwierzàt 20 samic z miejscami zagnie˝d˝enia podczas autopsji. Grupy zmniej ni˝ 16 zwierz´tami zmiejscami zagnie˝- Zaleca si´, by badanie by∏o wykonane na najbar- d˝enia mogà byç nieodpowiednie. Wyst´pujàca dziej odpowiednim gatunku, a stosowane powinny ÊmiertelnoÊç osobników rodzicielskich nie musi byç byç gatunki i rasy zwierzàt laboratoryjnych u˝ywa- przyczynà uniewa˝nienia badania, pod warunkiem ˝e nych powszechnie w badaniach toksycznoÊci w roz- nie przekracza 10 %.

1.6.2. Przygotowanie dawek zmu i toksykokinetyki badanej substancji lub substancji podobnych strukturalnie. Informacje te pomogà Je˝eli stosowany jest noÊnik lub inny dodatkowy w doborze w∏aÊciwego sposobu dawkowania. zwiàzek umo˝liwiajàcy podawanie substancji, to nale- ˝y braç pod uwag´ jego nast´pujàce charakterystycz- Równolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej ne cechy: wp∏yw na absorpcj´, rozmieszczenie, meta- grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest bolizm i retencj´ lub wydalanie badanej substancji; stosowany podczas podawania substancji. Wszystkie wp∏yw na w∏aÊciwoÊci chemiczne badanej substancji, grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç badaktóre mogà zmieniç jej charakterystyk´ toksykologicz- nej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach nà; wp∏yw na spo˝ywanie pokarmu i pobieranie wo- kontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób, dy przez zwierz´ta. NoÊnik nie powinien byç ani tok- jak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z nosyczny dla rozwoju, ani nie mo˝e mieç wp∏ywu na Ênikiem powinny otrzymywaç noÊnik wnajwy˝szej zarozrodczoÊç. stosowanej iloÊci (jak w grupie o najni˝szej stosowanej dawce). 1.6.3. Podawanie substancji 1.6.4. Badanie dawki granicznej Wzasadzie badana substancja powinna byç podawana codziennie od zagnie˝d˝enia (np. 5 dnia po sko- Je˝eli badanie w jednej dawce na poziomie przyjarzeniu) do dnia przed planowanym porodem za po- najmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ po podaniu domocà cesarskiego ci´cia. W przypadku gdy dost´pne ˝o∏àdkowym i przy zastosowaniu procedur opisanych sà wyniki badania wst´pnego, które nie wskazujà na w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania wysoki potencja∏ strat przed zagnie˝d˝eniem, to poda- mo˝liwych do zaobserwowania skutków toksycznych wanie substancji mo˝e byç przed∏u˝one na ca∏y okres i je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków na cià˝y, od dnia skojarzenia do dnia przed planowanym podstawie istniejàcych danych (np. w przypadku uÊmierceniem. Ogólnie wiadomo jest, ˝e niew∏aÊciwe zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie podobobchodzenie si´ ze zwierz´tami lub stres podczas cià- nych) to wtedy pe∏ne badanie ztrzema poziomami da- ˝y mo˝e powodowaç poronienia. Aby zapobiec poro- wek mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne. Spodziewanieniom spowodowanym przez czynniki niezwiàzane ne nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zazpodawanà substancjà, nale˝y unikaç niepotrzebnego stosowania wy˝szej dawki stosowanej do˝o∏àdkowo zak∏ócania spokoju ci´˝arnych samic, a tak˝e stresu w badaniu st´˝eƒ granicznych. W przypadku innych spowodowanego przez czynniki zewn´trzne takie jak sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê ha∏as. skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji cz´sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝- Nale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy da- liwy do uzyskania poziom nara˝enia (np. zastosowawek i równoleg∏à grup´ kontrol´. Zdrowe zwierz´ta nie po naniesieniu na skór´ nie powinno powodowaç powinny zostaç przypisane do grup nara˝anych ikon- ostrej toksycznoÊci miejscowej). trolnych w sposób losowy. Poziomy dawkowania powinny zostaç ustalone tak, by spowodowaç stopnio- 1.6.5. Podawanie substancji wanie skutków toksycznych. Najwy˝sza dawka powinna zostaç dobrana w taki sposób, by indukowaç tok- Badana substancja lub noÊnik sà zazwyczaj podasycznoÊç rozwojowà i/lub objawy toksyczne u samic wane do˝o∏àdkowo za pomocà sondy do˝o∏àdkowej (objawy kliniczne lub spadek masy cia∏a), ale nie ich lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Je˝eli stosowazgon bàdê powa˝ne cierpienie, chyba ˝e jest to ogra- ny jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego niczone w∏aÊciwoÊciami fizykochemicznymi lub w∏a- uzasadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne mo- ÊciwoÊciami biologicznymi badanej substancji. Przy- dyfikacje (zobacz pozycje 2, 3 i 4 piÊmiennictwa). Banajmniej jedna dawka poÊrednia powinna powodo- dana substancja powinna byç podawana codziennie, waç minimalne skutki toksyczne mo˝liwe do zaobser- w przybli˝eniu o tej samej porze dnia. wowania. Najni˝sza dawka nie powinna powodowaç jakiejkolwiek toksycznoÊci rozwojowej lub toksyczno- Dawka dla ka˝dego zwierz´cia powinna opieraç si´ Êci dla osobników rodzicielskich. Sekwencja malejà- na najbardziej aktualnych pomiarach masy cia∏a osobcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by mo˝na nika. Nale˝y byç jednak˝e ostro˝nym wdostosowywaby∏o wykazaç odpowiedê typu dawka–skutek i wyzna- niu dawki w ostatnim trymestrze cià˝y. Do wyboru czyç poziom bez obserwowanego szkodliwego skutku dawki stosowane powinny byç istniejàce dane, by za- (NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji malejà- pobiec nadmiernej toksycznoÊci dla osobnika maciecych dawek sà wspó∏czynniki owartoÊci 2—4, acz´sto rzystego. Je˝eli jednak takie objawy toksycznoÊci pododanie czwartej badanej grupy jest lepsze ni˝ stoso- jawià si´, to zwierz´ta te powinny zostaç wsposób huwanie bardzo du˝ych wspó∏czynników pomi´dzy daw- manitarny uÊmiercone. Je˝eli objawy takie pojawià kami (np. wi´kszych ni˝ 10). Chocia˝ celem jest ustale- si´ u kilku ci´˝arnych samic z nara˝anej grupy, to nanie wartoÊci NOAEL dla matek, to badania, w których le˝y wziàç pod uwag´ zakoƒczenie doÊwiadczenia ztà nie ustalono takiego poziomu, równie˝ sà mo˝liwe do grupà. Gdy substancja podawana jest przez zg∏´bnik, zaakceptowania (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). to powinna byç podawana w pojedynczej dawce przy pomocy sondy do˝o∏àdkowej lub kaniuli intubacyjnej. Poziomy dawek powinny zostaç ustalone Maksymalna obj´toÊç, jaka mo˝e zostaç podana jedz uwzgl´dnieniem istniejàce danych o toksycznoÊci, norazowo zwierz´ciu, zale˝y od jego rozmiarów. Obj´- a tak˝e informacji dodatkowych na temat metaboli- toÊç ta nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia-

∏a, z wyjàtkiem przypadku roztworów wodnych gdzie U zwierzàt ci´˝arnych nale˝y okreÊliç liczb´ cia∏ek stosowane mo˝e byç 2 ml/100 g masy cia∏a. Je˝eli ja- ˝ó∏tych. ko noÊnik stosuje si´ olej kukurydziany, to obj´toÊç nie powinna przekraczaç 0,4 ml/100 g masy cia∏a. Zmien- ZawartoÊç macicy powinna zostaç przebadana noÊç obj´toÊci powinna byç zminimalizowana przez pod kàtem liczby martwych zarodków lub p∏odów oraz dostosowanie st´˝enia tak, aby zapewniç sta∏à obj´- p∏odów ˝ywych. Wcelu oszacowania wzgl´dnego czatoÊç na wszystkich poziomach dawek. su Êmierci zarodka nale˝y opisaç stopieƒ resorpcji (zobacz pkt 1.2). 1.6.6. Obserwacje samic ci´˝arnych 1.6.10. Badanie p∏odów Obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane, a wyniki zapisywane przynajmniej raz dziennie, najle- Nale˝y okreÊliç p∏eç i mas´ cia∏a ka˝dego p∏odu. piej otej samej porze dnia, bioràc pod uwag´ szczyto- U ka˝dego p∏odu powinny zostaç przebadane wy okres przewidywanych skutków po podawaniu zmiany zewn´trzne (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa). substancji. Kondycja zwierzàt powinna byç opisywana z uwzgl´dnieniem ÊmiertelnoÊci, stanów agonalnych, Nale˝y przebadaç p∏ody pod kàtem zmian wszkiesta∏ych zmian wzachowaniu iwszystkich innych objalecie i tkankach mi´kkich (np. zmiany, zniekszta∏cenia wów wyraênej toksycznoÊci. i nieprawid∏owoÊci) (zobacz pozycje 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i24 piÊmiennic- 1.6.7. Masa cia∏a i spo˝ycie pokarmu twa). Po˝àdana, ale niewymagana jest kategoryzacja zmian p∏odowych. Je˝eli jednak jest ona wykonywa- Zwierz´ta powinny byç wa˝one w dniu zerowym na, to nale˝y wyraênie podaç kryteria definicji ka˝dej lub nie póêniej ni˝ wtrzecim dniu (zwierz´ta po skojakategorii. Szczególnà uwag´ nale˝y zwróciç na uk∏ad rzeniu dostarczone przez dostawc´ zewn´trznego), narozrodczy, który powinien zostaç przebadany pod kàst´pnie pierwszego dnia nara˝enia i przynajmniej co tem zmian w rozwoju. trzy dni podczas okresu podawania substancji oraz w dniu przewidywanego uÊmiercenia. W przypadku gryzoni oko∏o po∏owa miotów powinna byç przebadana pod kàtem zmian szkieleto- Spo˝ycie pokarmu powinno byç zapisywane wodwych. Pozosta∏a cz´Êç powinna byç przebadana pod st´pach trzydniowych i zbiegaç si´ w czasie z pomiawzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich przy zastosorami masy cia∏a. waniu uznanych w∏aÊciwych metod serii przekrojów lub techniki przekrojów ca∏oÊciowych. 1.6.8. Badanie sekcyjne W przypadku zwierzàt innych ni˝ gryzonie, np.: Samice powinny zostaç uÊmiercone na dzieƒ króliki, wszystkie p∏ody powinny zostaç przebadane przed przewidywanym porodem. Samice wykazujàce pod wzgl´dem zmian wszkielecie jak itkankach mi´kobjawy poronienia lub przedwczesnego porodu przed kich. Cia∏a tych p∏odów powinny byç ocenione przez zaplanowanym uÊmierceniem powinny zostaç sekcj´ pod kàtem zmian w tkankach mi´kkich, do czeuÊmiercone ipoddane dok∏adnym ogl´dzinom makrogo zalicza si´ równie˝ procedury do dalszego szacoskopowym. wania wewn´trznej struktury serca (zobacz pozycja 25 piÊmiennictwa). G∏owy po∏owy p∏odów przebadanych W czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia lub zgonu w ten sposób powinny zostaç oddzielone i poddane podczas doÊwiadczenia samice powinny zostaç przebadaniom pod wzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich badane makroskopowo pod kàtem nieprawid∏owoÊci (oczy, mózg, komory nosowe i j´zyk) przy zastosowaw budowie i zmian patologicznych. W celu unikni´cia niu standardowych metod serii przekrojów (zobacz zasugerowania wyniku, badania samic podczas ci´cia pozycja 26 piÊmiennictwa) lub innych równie czu∏ych cesarskiego oraz p∏odów powinny byç wykonane bez metod. Cia∏a tych p∏odów i pozosta∏e nienaruszone wiedzy o tym, z jakiej grupy one pochodzi∏y. p∏ody powinny zostaç przebadane pod wzgl´dem zmian w szkielecie przy zastosowaniu tych samych 1.6.9. Badanie zawartoÊci macicy metod, jak opisane dla gryzoni. Natychmiast po zakoƒczeniu porodu lub tu˝ po 2. WYNIKI Êmierci macice powinny byç usuni´te, a stopieƒ zaawansowania cià˝y okreÊlony. Macice, których wyglàd 2.1. Opracowanie wyników nie wskazuje na cià˝´, powinny zostaç poddane dalszym badaniom (np. barwienie siarczkiem amonu Dane powinny byç zapisywane oddzielnie dla ka˝- ugryzoni ibarwienie Salewskiego lub innà odpowied- dej samicy, jak i jej potomstwa i zestawione w formie nià metodà dla królików), by potwierdziç brak cià˝y tabel. Nale˝y wykazaç dla ka˝dej badanej grupy i ka˝- (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa). dego pokolenia liczb´ zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczb´ zwierzàt martwych podczas badania lub Nale˝y zwa˝yç macice samic ci´˝arnych wraz uÊmierconych zpowodów humanitarnych, czas zgonu z szyjkà macicy. Nie nale˝y zapisywaç masy macic sa- lub uÊmiercenia, liczb´ samic w cià˝y, liczb´ zwierzàt mic ci´˝arnych uzyskanych od zwierzàt, które pad∏y wykazujàcych objawy toksycznoÊci, opis zaobserwopodczas doÊwiadczenia. wanych objawów toksycznoÊci, w tym czas ich poja-

wienia si´, trwanie i nasilenie objawów, rodzaje ob- niki badania pozwalajà na rozró˝nienie pomi´dzy serwacji zarodków/p∏odów i wszystkie inne znaczàce skutkami rozwojowymi nast´pujàcymi przy niewystàdane dotyczàce p∏odów. pieniu toksycznoÊci ogólnej i tymi, które wyst´pujà tylko w warunkach nara˝enia na dawki toksyczne dla Dane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà zwierzàt rodzicielskich. metodà statystycznà. Ka˝dy p∏ód nale˝y traktowaç w analizie danych jako jednostk´. Stosowane powin- 3. SPRAWOZDANIE ny byç ogólnie uznane metody statystyczne; wybrane jako cz´Êç sk∏adowa uk∏adu doÊwiadczenia, a ich wy- Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce inbór powinien byç uzasadniony. Dane zwierzàt, które formacje: nie prze˝y∏y do planowanego uÊmiercenia, tak˝e powinny byç podane. Mogà one równie˝ byç uwzgl´d- Badana substancja: nione w obliczonych wartoÊciach Êrednich z ka˝dej grupy. Znaczenie takich wyników oraz ich uwzgl´dnie- — stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏anie bàdê te˝ nieuwzgl´dnienie w Êrednich dla grup(y) ÊciwoÊci fizykochemiczne, w ka˝dym przypadku powinno byç oszacowane i uzasadnione. — identyfikacja, w tym numer CAS, je˝eli jest znany/ustalony, 2.2. Ocena wyników — czystoÊç. Obserwacje poczynione w przeprowadzonym badaniu toksycznoÊci rozwoju przedporodowego powin- NoÊnik (je˝eli by∏ stosowany): ny byç ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych — uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli zosta∏ zastoskutków. Ocena ta powinna zawieraç nast´pujàce insowany inny noÊnik ni˝ woda. formacje: — wyniki badania zarodków/p∏odów i samic w tym Badane zwierz´ta: ocena powiàzaƒ lub ich brak pomi´dzy nara˝e- — gatunek/szczep, niem zwierzàt badanych na badanà substancj´ oraz wyst´powaniem i nasileniem wszystkich ob- — liczba i wiek zwierzàt, serwacji, — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, — kryteria stosowane w kategoryzacji zmian zepasza itp., wn´trznych, tkanek mi´kkich i szkieletu p∏odów, je˝eli dokonano takiej kategoryzacji, — masy poszczególnych zwierzàt na poczàtku do- Êwiadczenia. — w celu wspomo˝enia interpretacji danych z do- Êwiadczenia, dane z wczeÊniej przeprowadzonych Warunki badania: badaƒ jako dane kontrolne, je˝eli jest to w∏aÊciwe, — uzasadnienie wybranych dawek, — dane liczbowe stosowane wobliczaniu wszystkich wartoÊci procentowych i odpowiednich wspó∏- — szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substanczynników, cji, wtym przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´- ˝enie, trwa∏oÊç i jednorodnoÊç preparatu, — odpowiednià analiz´ statystycznà uzyskanych wyników, w tym wystarczajàce informacje na temat — szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substanmetody analizy tak, aby niezale˝ny recenzent/stacji, tystyk móg∏ ponownie dokonaç obliczeƒ i odtworzyç analiz´. — przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji z zawartoÊci w paszy/wodzie pitnej na dawk´ rze- W badaniach, które wykazujà brak objawów dziaczywistà (mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje ∏ania toksycznego, pod uwag´ nale˝y braç dalsze bataka koniecznoÊç, dania dotyczàce absorpcji i biodost´pnoÊci badanej substancji. — warunki Êrodowiskowe, 2.3. Interpretacja wyników — szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej. Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodo- Wyniki: wym dostarcza informacji na temat skutków dzia∏ania toksycznego na samice i wewnàtrzmaciczny rozwój Dane o toksycznoÊci dla samic wed∏ug dawki poich potomstwa powtarzanego podawania drogà po- winny zawieraç, ale nie ograniczaç si´ do: karmowà substancji w czasie cià˝y. Wyniki badaƒ powinny byç interpretowane w po∏àczeniu z wynikami — liczby zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczby z badaƒ podprzewlek∏ych, rozmna˝ania, toksykokine- zwierzàt prze˝ywajàcych badanie, liczby zwierzàt tycznych i innych. Poniewa˝ nacisk po∏o˝ony jest za- ci´˝arnych, liczby poronieƒ i przedwczesnych porówno na toksycznoÊç ogólnà, jak irozwojowà, to wy- rodów,

— dni padni´ç podczas badania iliczby zwierzàt, któ- 2) Kimmel, C.A., Fransic, E.Z. (1990). Proceedings re prze˝y∏y do koƒca badania, of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. — danych zwierzàt, które nie prze˝y∏y do koƒca bada- Fundam. Appl. Toxicol. 14, 386—398. nia, powinny byç podane, ale nie nale˝y ich uwzgl´dniaç w statystycznych porównaniach po- 3) Wong, B.A. et al. (1997). Developing Specialized Inmi´dzy grupami, halation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17, 1—8. — dnia zaobserwowania ka˝dego nietypowego objawu klinicznego i jego nast´pstw, 4) US EPA (1985) Subpart E — Specific Organ Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmen- — masy cia∏a, zmiany masy cia∏a i masy macicy sa- tal Toxicity Study. micy ci´˝arnej, w tym opcjonalnie zmiany masy 5) Salewski E. (1964). Faerbermethode zum Makrocia∏a skorygowanej o mas´ macicy samicy ci´˝arskopischen Nachweis von Implantations Stellen nej, am Uterus der Ratte. Nauyn–Schmeidebergs — spo˝ycia paszy i, je˝eli mierzone, spo˝ycie wody, Arch. Pharmakol. Exp. Pathol. 247, 367. — wyników z sekcji, w tym masy macicy, 6) Edwards J.A. (1968). The External Development of the Rabbit and Rat Embryo. In: Adv. Teratol. — wartoÊci NOAEL dla skutków dzia∏ania na osobni- D.H.M. Woolam (ed.), Vol. 3. Academic Press, NY. ki pokolenia rodzicielskiego idla skutków dzia∏ania na rozwój. 7) Inouye M. (1976). Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congen. Anom. 16, 171—173. Rozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla samic z zagnie˝d˝eniami: 8) Igarashi E. et al. (1992). Frequency of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double — liczba cia∏ek ˝ó∏tych, Staining Technique for Ossified and Cartilaginous — liczba zagnie˝d˝eƒ, liczba iprocent martwych i˝y- Skeleton in Rat Fetuses. Congen. Anom. 32, wych p∏odów i resorpcji, 381—391. 9) Kimmel C.A. et al. (1993). Skeletal Developmental — liczba iprocent poronieƒ przed ipo zagnie˝d˝eniu. Following Heat Exposure in Rat. Teratology 47, 229—242. Rozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla samic z ˝ywymi p∏odami: 10) Marr M.C. et al. (1988). Comparison of Sinle and Double Staining for Evaluation of Skeletal Deve- — liczba i wartoÊci procentowe dla ˝ywego potomlopment: the Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD stwa, Rats. Teratology 37, 476. — stosunek p∏ci, 11) Barrow M.V., Taylor W.J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses. — masa cia∏a p∏odów najlepiej zebrana wed∏ug p∏ci, J. Morphol. 127, 291—306. — zniekszta∏cenia zewn´trzne, tkanki mi´kkiej iszkie- 12) Fritz H. (1974). Prenatal Ossification in Rabbits letu oraz inne wa˝ne zmiany, as Indicative of Fetal Maturity, Teratology 11, — kryteria kategoryzacji, je˝eli zosta∏a ona zastoso- 313—320. wana, 13) Gibson J.P. et al. (1966). Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 9, — ca∏kowita liczba iwartoÊci procentowe dla p∏odów 398—408. i matek z jakimikolwiek zmianami zewn´trznymi, zmianami tkanki mi´kkiej iszkieletu, atak˝e rodza- 14) Kimmel C.A., Wilson J.G. (1973). Skeletal Deviaje i wyst´powanie poszczególnych nieprawid∏otion in Rats: Malformations or Variations? TeratowoÊci i inne wa˝ne zmiany. logy 8, 309—316. Omówienie wyników. 15) Marr M.C. et al. (1992). Developmental Stages of the CD (Sprague–Dawley) Rat Skeleton After Wnioski. Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46, 169—181. 4. PIÂMIENNICTWO 16) Monie I.W. et al. (1965). Dissection Procedures for 1) Kavlock R.Jet al. (1996). ASimulation Study of the Rat Fetuses Permitting Alizarin Red Staining Influence of Study Desigh on the Estimation of Skeleton and Histological Study of Viscera. of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Supplement to Teratology Workshop Manual, Risk Anal. 16, 399—400. pp. 163—173.

17) Spark C. Dawson A.B. (1928). The Order and Time 23) Wilson J.G. and Fraser F.C. (eds.) (1977). Handboof Appearance of Centers of Ossification in the Fo- ok of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY. re and Hind Limbs of the Albino Rat, With Special Reference to the Possible Influence of the Sex Fac- 24) Varnagy L. (1980). Use of Recent Fetal Bone Stator. Am. J. Anat. 41, 411—445. ining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28, 18) Staples R.E. Schnell V.L. (1964). Refinements in Ra- 233—239. pid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technol. 39, 25) Staples R.E. (1974). Detection of Visceral Alterna- 61—63. tions in Mammalian Fetuses. Teratology 9, 37—38. 19) Strong R.M. (1928). The Order, Time and Rate 26) Van Julsingha E.B. and C.G. Bennett (1977). ADisof Ossification of the Albino Rat (Mus norvegicus secting Procedure for the Detection of Anomalies albinus) Skeleton. Am. J. Anat. 36, 313–355. in the Rabbit Fetal Head. In: Methods in Prenatal 20) Stuckhardt J.L. and Poppe S.M. (1984). Fresh Vi- Toxicology (eds. D. Neubert, H.J. Merker and T.E. sceral Examination of Rat and Rabbit Fetuses Kwasigroch). Universoity of Chicago, Chicago, IL, Used in Teratogenicity Testing. Teratogen. Carcipp. 126—144. nogen. Mutagen. 4, 181—188. 27) US EPA (1991). Guidelines for Developmental 21) Walker D.G. Wirtschafter Z.T. (1957). The Genesis Toxicity Risk Assessment. Fed. Register 56, of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL. 63798—63826. 22) Wilson J.G. (1965). Embryological Considerations in Teratology. In: Teratology: Principles and Tech- 28) Wise D.L. et al (1997). Terminology of Developniques, J.G. Wilson and J. Warkany (eds.), Univer- mental Abnormalities in Common Laboratory sity of Chicago, Chicago, IL, pp. 251—277. Mammals (Version 1). Teratology 55, 249—292. Za∏àcznik nr 8 B.35. DZIA¸ANIE TOKSYCZNE NA ROZRODCZOÂå W WARUNKACH TESTU DWUPOKOLENIOWEGO 1. METODA toksycznoÊci rozwojowej, bàdê te˝ mogà byç one cz´- Êcià osobnych badaƒ z u˝yciem odpowiednich metod Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- badawczych. sanej w Wytycznej OECD nr 416 (2001). 1.2. Zasada metody badawczej 1.1. Wst´p Badana substancja podawana jest w stopniowa- Niniejsza metoda — dzia∏anie toksyczne na rozrod- nych dawkach kilku grupom samców i samic. W celu czoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego — zo- wywo∏ania jakichkolwiek szkodliwych skutków dla sta∏a opracowana wcelu dostarczenia ogólnych infor- spermatogenezy samce pokolenia Ppowinny otrzymymacji dotyczàcych wp∏ywu badanej substancji na nie- waç badanà substancj´ w okresie wzrostu i przynajnaruszalnoÊç i wydajnoÊç uk∏adów rozrodczych sam- mniej przez jeden pe∏ny cykl spermatogenetyczny ca i samicy, w tym na funkcjonowanie gonad, cykl ru- (wprzybli˝eniu 56 dni umyszy i70 dni uszczura). Dziajowy, zachowanie w czasie kojarzenia, zap∏odnienie, ∏anie na nasienie jest oceniane zwykorzystaniem kilku cià˝´, poród, laktacj´ iodsadzanie oraz rozwój iwzrost parametrów (np. morfologia nasienia i jego ruchlipotomstwa. Badania mogà tak˝e dostarczyç informa- woÊç) oraz w badaniach histopatologicznych. Je˝eli cji o wp∏ywie badanej substancji na zachorowalnoÊç dost´pne sà archiwalne dane o spermatogenezie ponoworodków, ÊmiertelnoÊç w okresie neonatalnym, chodzàce z poprzednio przeprowadzonych badaƒ wst´pnych danych o przedporodowym i poporodo- o wystarczajàcym okresie powtarzanego nara˝enia, wym dzia∏aniu toksycznym. Wyniki uzyskane wprzed- np. badanie 90-dniowe, to samce pokolenia P nie mustawionym badaniu mogà s∏u˝yç jako wskazówki dla szà byç uwzgl´dniane w szacowaniu. Zaleca si´ jednast´pnych badaƒ. Oprócz badania wzrostu i rozwoju nak˝e, aby próbki lub zapisy cyfrowe dotyczàce nasiepokolenia F1 dzi´ki niniejszej metodzie mo˝na tak˝e nia pokolenia P by∏y zachowane tak, by umo˝liwiç ich oceniç integralnoÊç iwydajnoÊç uk∏adów rozrodczych póêniejsze oszacowanie. Samice pokolenia P powinny samców isamic, atak˝e wzrost irozwój pokolenia F2. otrzymywaç badanà substancj´ w okresie wzrostu Dalsze informacje o dzia∏aniu toksycznym na rozwój i przez kilka pe∏nych cyklów rujowych tak, aby wykryç p∏odu i zaburzeniach czynnoÊciowych mogà byç uzy- jakikolwiek szkodliwy wp∏yw tej substancji na cykl ruskane w badaniach dodatkowych do badania zapre- jowy. Badanà substancj´ podaje si´ zwierz´tom rodzizentowanego w niniejszej metodyce przy zastosowa- cielskim (P) podczas ich kojarzenia, podczas cià˝y i do niu metody dla toksycznoÊci rozwojowej i/lub neuro- odsadzenia potomstwa F1. Po odsadzeniu podawanie

substancji pokoleniu F1 kontynuuje si´ w okresie ich Klatki nale˝y ustawiç w taki sposób, by zminimalizowzrostu, a˝ do osiàgni´cia dojrza∏oÊci, w okresie koja- waç mo˝liwy wp∏yw ich ustawienia na wyniki badania. rzenia ido uzyskania potomstwa — pokolenia F2 ana- Ka˝demu zwierz´ciu nale˝y przypisaç jego w∏asny nust´pnie a˝ do usamodzielnienia pokolenia F2. mer identyfikacyjny. Dla pokolenia P nale˝y to uczyniç przed rozpocz´ciem podawania substancji. Wprzypad- Obserwacje kliniczne i badania patologiczne pro- ku pokolenia F1 nale˝y to uczyniç przy odsadzaniu wadzi si´ u wszystkich zwierzàt pod kàtem objawów zwierzàt, które zosta∏y wybrane do kojarzenia. Zapisy dzia∏ania toksycznego ze zwróceniem szczególnej wskazujàce na pochodzenie miotu powinny byç zachouwagi na skutki wskazujàce na zaburzenia budowy wane dla wszystkich wybranych zwierzàt pokolenia F1. iczynnoÊci uk∏adów rozrodczych samic isamców oraz Ponadto tak szybko, jak to jest mo˝liwe, po porodzie na wzrost i rozwój potomstwa. w przypadku, gdy bierze si´ pod uwag´ badania czynnoÊciowe lub wa˝enie poszczególnych osobników, za- 1.3. Opis metody badawczej leca si´ identyfikacj´ osobników m∏odych. 1.3.1. Wybór gatunku zwierzàt Zwierz´ta rodzicielskie (P) w momencie rozpocz´- cia podawania badanej substancji powinny byç wwie- Zalecanym gatunkiem jest szczur. Je˝eli stosowa- ku 5 do 9 tygodni. Zwierz´ta ze wszystkich grup badany jest inny gatunek zwierz´cia, to nale˝y to uzasad- nych powinny, na tyle, na ile to mo˝liwe, byç w tym niç. W takiej sytuacji konieczne wówczas b´dà pewne samym wieku i mieç takà samà mas´ cia∏a. modyfikacje badania. Wbadaniu nie powinny byç stosowane rasy charakteryzujàce si´ niskà p∏odnoÊcià 1.4. Sposób post´powania lub dobrze znanà wysokà cz´stotliwoÊcià wyst´powania wad rozwojowych. Na poczàtku badania ró˝nica 1.4.1. Liczba i p∏eç zwierzàt wmasie cia∏a badanych zwierzàt powinna byç jak najmniejsza inie powinna przekraczaç 20 % Êredniej ma- Ka˝da grupa nara˝ana i kontrolna powinna sk∏asy cia∏a ka˝dej z p∏ci. daç si´ z odpowiedniej liczby zwierzàt, tj. powinna liczyç nie mniej ni˝ 20 samic ci´˝arnych lub bliskich po- 1.3.2. Warunki przetrzymywania i karmienie rodu. W przypadku substancji powodujàcych niektóre niepo˝àdane skutki zwiàzane znara˝eniem (np. steryl- Temperatura wpomieszczeniach doÊwiadczalnych noÊç lub nadmierna toksycznoÊç w przypadku stosopowinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna po- wania wysokich dawek) spe∏nienie tego warunku mowinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych od- ˝e byç niemo˝liwe. Celem jest uzyskanie takiej iloÊci chyleniach mi´dzy 30 % a70 % (wy˝sza wartoÊç jedy- ci´˝arnych samic, by zapewniç odpowiednie oszaconie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stoso- wanie potencja∏u substancji w zakresie wp∏ywu na waç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 go- p∏odnoÊç, cià˝´, zachowanie osobników rodzicielskich dzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç i osesków oraz wzrost i rozwój potomstwa F1 od zastosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapew- p∏odnienia do osiàgni´cia dojrza∏oÊci oraz rozwój ich niç nieograniczony dost´p do wody. Wybór paszy mo- potomstwa (F2) do momentu odsadzenia. Dlatego te˝ ˝e zale˝eç od koniecznoÊci zapewnienia odpowiedniej brak po˝àdanej iloÊci samic wcià˝y (tj. 20) nie zawsze domieszki badanej substancji, je˝eli jest ona podawa- oznacza uniewa˝nienie badania, a ka˝dy przypadek na tà metodà. powinien byç oceniany indywidualnie. Zwierz´ta mogà byç przetrzymywane pojedynczo 1.4.2. Przygotowanie substancji w okreÊlonych dawlub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci. Kojarzenie po- kach winno odbywaç si´ w klatkach przystosowanych do tych celów. Po kopulacji skojarzone samice powinny Zaleca si´, by substancj´ podawaç drogà pokarbyç przetrzymywane pojedynczo w klatkach przysto- mowà (z pokarmem, wodà pitnà lub za pomocà sonsowanych do porodu i macierzyƒstwa. Skojarzone dy), chyba ˝e inna droga podawania wydaje si´ barszczury mogà tak˝e byç trzymane w ma∏ych grupach dziej w∏aÊciwa. i rozdzielone na jeden lub dwa dni przed porodem. Skojarzonym zwierz´tom nale˝y dostarczyç odpo- Je˝eli jest to konieczne, to badana substancja powiedni materia∏ do budowy gniazda, gdy okres poro- winna byç rozpuszczana lub zawieszana w odpowieddu jest bliski. nim noÊniku. Zaleca si´, o ile jest to mo˝liwe, stosowanie w pierwszej kolejnoÊci roztworów/zawiesin 1.3.3. Przygotowanie zwierzàt wodnych, awnast´pnej kolejnoÊci roztworów/emulsji olejowych (w oleju kukurydzianym) i w koƒcu innych Stosowane powinny byç zdrowe zwierz´ta aklima- noÊników. W przypadku stosowania noÊników innych tyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków labo- ni˝ woda powinny byç znane ich w∏aÊciwoÊci toksykoratoryjnych inieu˝ywane wczeÊniej winnych doÊwiad- logiczne. Nale˝y okreÊliç trwa∏oÊç badanej substancji czeniach. Powinny byç znane: gatunek, szczep, êród∏o w noÊniku. pochodzenia, p∏eç, masa cia∏a i/lub wiek. Pokrewieƒstwa pomi´dzy zwierz´tami powinny byç znane tak, by 1.4.3. Dawkowanie uniknàç krzy˝owania zwierzàt spokrewnionych. Zwierz´ta przypisuje si´ losowo do grupy kontrolnej i gru- Nale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy dapy nara˝anej (zalecany jest dobór wed∏ug masy cia∏a). wek irównoleg∏à kontrol´. Najwy˝sza dawka powinna

byç dobrana wtaki sposób, by wywo∏aç dzia∏anie tok- — je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków syczne, ale nie powodowaç Êmierci lub cierpienia na podstawie istniejàcych danych (np. wprzypadzwierzàt, chyba ˝e jest to ograniczone w∏aÊciwoÊciami ku zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie pofizykochemicznymi lub skutkami biologicznymi bada- dobnych). nej substancji. W przypadku niespodziewanej ÊmiertelnoÊci wynoszàcej w przybli˝eniu mniej ni˝ 10 % Spodziewane nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na wpokoleniu zwierzàt rodzicielskich (P) badanie wdal- potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki podawanej droszym ciàgu mo˝liwe jest do zaakceptowania. Sekwen- gà pokarmowà ni˝ w badaniu dawki granicznej. cja malejàcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by W przypadku innych sposobów podawania, takich jak mo˝na by∏o wykazaç odpowiedê typu dawka-skutek inhalacyjne bàdê skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne iwyznaczyç poziom bez obserwowanego skutku szko- badanej substancji, takie jak jej rozpuszczalnoÊç cz´- dliwego (NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝liwy do uzymalejàcych dawek sà wspó∏czynniki o wartoÊci od skania poziom nara˝enia. 2—4, a cz´sto dodanie czwartej badanej grupy jest lepsze ni˝ stosowanie bardzo du˝ych wspó∏czynników 1.4.5. Podawanie substancji pomi´dzy dawkami (np. wi´kszych ni˝ 10). Wprzypadku badaƒ drogà pokarmowà odst´p pomi´dzy dawka- Badana substancja powinna byç podawana zwiemi nie powinien byç wi´kszy ni˝ 3. Poziomy dawek po- rz´tom 7 dni wtygodniu. Preferowane jest podawanie winny zostaç ustalone z uwzgl´dnieniem istniejàcych substancji drogà pokarmowà (w paszy, w wodzie lub danych o toksycznoÊci, a tak˝e informacji dodatko- za pomocà sondy do˝o∏àdkowej). Je˝eli stosowany wych na temat metabolizmu itoksykokinetyki badanej jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego uzasubstancji lub substancji opodobnej strukturze. Infor- sadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne modyfimacje te pomogà w doborze w∏aÊciwego sposobu kacje. Badana substancja powinna byç podawana dawkowania. wszystkim zwierz´tom tà samà metodà podczas w∏a- Êciwego okresu doÊwiadczenia. Je˝eli substancj´ po- Równolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej daje si´ do˝o∏àdkowo, to powinno stosowaç si´ sond´ grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest do˝o∏àdkowà. Obj´toÊç podawanej cieczy jednorazostosowany podczas podawania substancji. Wszystkie wo nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia∏a grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç bada- (0,4ml/100 g masy cia∏a w przypadku oleju kukurynej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach dzianego), z wyjàtkiem roztworów wodnych, gdy stokontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób, sowaç mo˝na 2 ml/100 gmasy cia∏a. Z wyjàtkiem subjak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z no- stancji dra˝niàcych lub ˝ràcych, które zwi´kszajà skut- Ênikiem powinny otrzymywaç ten noÊnik wnajwy˝szej ki swego dzia∏ania ze wzrostem st´˝enia, zmiennoÊç z zastosowanych obj´toÊci. Je˝eli badana substancja obj´toÊci powinna byç minimalizowana przez dostopodawana wpaszy powoduje zmniejszenie pobierania sowanie st´˝enia tak, by zapewniç sta∏à obj´toÊç we lub wykorzystania paszy, to pod uwag´ mo˝e byç bra- wszystkich dawkach. W badaniach z zastosowaniem na koniecznoÊç zastosowania pary grup kontrolnych. sondy m∏ode b´dà otrzymywaç badanà substancj´ Zamiast pary grup kontrolnych mo˝na wykorzystaç da- poÊrednio zmlekiem, dopóki nie rozpocznie si´ po odne zkontrolowanych badaƒ szacujàcych skutki obni˝o- sadzeniu podawanie substancji w typowy dla nich nego spo˝ycia pokarmu na parametry rozmna˝ania. sposób. W badaniach z paszà lub wodà pitnà m∏ode b´dà dodatkowo otrzymywaç badanà substancj´ bez- Nale˝y braç pod uwag´ nast´pujàce cechy charak- poÊrednio, gdy rozpocznà samodzielnie spo˝ywaç poterystyczne noÊnika iinnych dodatków: wp∏ywy na ab- karm podczas ostatniego tygodnia okresu laktacji. sorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm lub retencj´ badanej substancji; wp∏ywy na w∏asnoÊci chemiczne ba- W przypadku substancji podawanych w pokarmie danej substancji, które mogà zmieniç jej w∏aÊciwoÊci lub w wodzie pitnej wa˝ne jest upewnienie si´, ˝e dotoksykologiczne; wp∏ywy na spo˝ywanie pokarmu lub dane iloÊci badanej substancji nie zak∏ócajà normalnej wody i wp∏yw na stan fizjologiczny zwierz´cia. równowagi pokarmowej i wodnej. Je˝eli badana substancja podawana jest w pokarmie, to jej iloÊç mo˝e 1.4.4. Badanie dawki granicznej byç wyra˝ona w postaci sta∏ego st´˝enia w pokarmie (ppm) lub wpostaci sta∏ej dawki wzgl´dem masy cia∏a Pe∏ne badanie z u˝yciem substancji podawanej zwierz´cia; ka˝dy inny sposób wyra˝enia dawki musi wró˝nych dawkach mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzeb- byç opisany. W przypadku podawania sondà substanne w przypadku, gdy: cja podawana powinna byç o ustalonych porach dnia idostosowywana przynajmniej raz wtygodniu tak, aby — badanie prowadzone drogà pokarmowà przy za- utrzymaç sta∏y jej poziom wzgl´dem masy cia∏a zwiestosowaniu jednej dawki na poziomie przynaj- rz´cia. Pod uwag´ powinno si´ braç informacje oprzemniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ albo podania nikaniu przez barier´ ∏o˝yska, dostosowujàc dawk´ w paszy lub w wodzie substancji w iloÊci stano- substancji podawanej sondà wzgl´dem masy. wiàcej odpowiedni ekwiwalent procentowy badanej substancji iprzy zastosowaniu procedur opisa- 1.4.6. Uk∏ady doÊwiadczalne nych w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania mo˝liwych do zaobserwowania objawów Codzienne podawanie substancji w okreÊlonych dzia∏ania toksycznego zarówno u zwierzàt rodzi- dawkach samcom i samicom rodzicielskim (P) powincielskich, jak i u ich potomstwa, no rozpoczàç si´ wtedy, gdy sà one wwieku 5 do 9 ty-

godni. Codzienne podawanie substancji samcom isa- Pary, które nie majà potomstwa, powinny byç micom pokolenia F1 powinno rozpoczàç si´ przy od- zbadane wcelu stwierdzenia przyczyny niep∏odnoÊci. sadzeniu; nale˝y pami´taç, ˝e w przypadku podawa- Konieczne mogà byç takie procedury, jak dopuszczenia badanej substancji z paszà lub wodà pitnà bezpo- nie do ponownego kojarzenia z innymi samcami lub Êrednie nara˝enie m∏odych F1 na badanà substancj´ samicami, mikroskopowe badanie organów rozrodmo˝e wystàpiç ju˝ w okresie laktacji. Dla obu p∏ci czych oraz badanie cyklu rujowego lub spermatoge- (P i F1) podawanie substancji powinno byç kontynu- nezy. owane przez przynajmniej 10 tygodni przed okresem kojarzenia. Podawanie substancji powinno byç konty- 1.4.7.3. Drugie kojarzenie nuowane uobu p∏ci podczas 2 tygodni okresu kojarzenia. Samce nale˝y w sposób humanitarny uÊmierciç Wpewnych przypadkach, takich jak zmiany liczebiprzebadaç, je˝eli nie sà niezb´dne do oceny skutków noÊci miotów spowodowane nara˝eniem na badanà reprodukcyjnych. W przypadku samic rodzicielskich substancj´ lub obserwacja podobnych skutków (P) podawanie substancji powinno byç kontynuowane w pierwszym kojarzeniu zaleca si´ ponowne skojarzeprzez okres cià˝y, a˝ do odsadzenia pokolenia F1. Pod nie doros∏ych Plub F1 wcelu uzyskania drugiego miouwag´ powinno si´ braç modyfikacje schematu poda- tu. Zaleca si´ ponowne kojarzenie samic lub samców, wania substancji wzale˝noÊci od dost´pnych informa- które nie wyda∏y miotu ze sprawdzonymi osobnikami cji dotyczàcych badanej substancji; nale˝y uwzgl´dniç przeciwnej p∏ci. Je˝eli wytworzenie drugiego miotu istniejàce dane ojej toksycznoÊci, indukcji metabolicz- jest uznane za konieczne w którymkolwiek pokoleniu nej lub bioakumulacji. Dawka stosowana dla ka˝dego to zwierz´ta powinny byç ponownie kojarzone mniej zwierz´cia powinna byç wyznaczona przy uwzgl´dnie- wi´cej tydzieƒ po odsadzeniu ostatniego miotu. niu najnowszych pomiarów masy jego cia∏a. Nale˝y byç ostro˝nym podczas dostosowywania dawki 1.4.7.4. WielkoÊç miotu w ostatnim trymestrze cià˝y. Zwierz´tom nale˝y pozwoliç na normalne wydanie Nara˝anie samców isamic PiF1 powinno trwaç a˝ miotu i wychowywanie potomstwa, a˝ do jego odsado zakoƒczenia doÊwiadczenia. Wszystkie doros∏e dzenia. Standaryzacja rozmiarów miotu jest post´posamce i samice P i F1 powinny zostaç w sposób hu- waniem opcjonalnym. Je˝eli stosuje si´ standaryzacj´ manitarny uÊmiercone, je˝eli nie sà potrzebne do dal- miotów, to zastosowana metoda powinna byç szczeszych ocen skutków. Potomstwo F1 niewybrane do ko- gó∏owo opisana. jarzenia i potomstwo F2 powinno byç w sposób humanitarny uÊmiercone po odsadzeniu. 1.5. Obserwacje 1.4.7. Sposób kojarzenia 1.5.1. Obserwacje kliniczne 1.4.7.1. Kojarzenie rodziców (P) Ogólne obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane codziennie, a w przypadku podawania sondà Dla ka˝dego kojarzenia, ka˝da samica powinna byç czas przeprowadzenia obserwacji powinien uwzgl´dumieszczona z jednym samcem z tej samej grupy na- niaç przewidywany szczytowy okres nasilenia skutków ra˝anej (kojarzenie 1:1) a˝ do kopulacji lub do zakoƒ- po nara˝eniu. Zmiany w zachowaniu, objawy trudnej czenia dwutygodniowego okresu. Ka˝dego dnia sami- lub przed∏u˝onej cià˝y iwszystkie objawy cià˝y powince powinny byç badane na obecnoÊç nasienia lub czo- ny byç zapisane. Ponadto bardziej szczegó∏owe badapa pochwowego. Dzieƒ zerowy cià˝y okreÊla si´ jako nie ka˝dego zwierz´cia powinno byç przeprowadzone dzieƒ odkrycia nasienia lub czopa pochwowego. przynajmniej raz w tygodniu; najdogodniej uczyniç to W przypadku niepowodzenia kojarzenia pod uwag´ podczas jego wa˝enia. Dwa razy dziennie, a podczas mo˝na wziàç ponowne kojarzenie zsamcami tej samej weekendu raz dziennie wszystkie zwierz´ta obserwuje grupy. Kojarzone pary nale˝y wyraênie okreÊliç w da- si´, poszukujàc zwierzàt w stanie agonalnym oraz panych. Nale˝y unikaç kojarzenia rodzeƒstwa. d∏ych. 1.4.7.2. Kojarzenie pokolenia F1 1.5.2. Masa cia∏a ispo˝ycie paszy/wody osobników rodzicielskich Do kojarzenia potomstwa F1 przynajmniej jeden samiec i jedna samica powinny byç wybrane przy od- Samice rodzicielskie (PiF1) powinny byç zwa˝one sadzaniu zka˝dego miotu do kojarzenia zinnymi m∏o- pierwszego dnia nara˝enia, a nast´pnie przynajmniej dymi tej samej grupy nara˝anej, ale innego miotu, aby raz na tydzieƒ. Samice rodzicielskie (P i F1) powinny daç pokolenie F2. Wybór m∏odych z ka˝dego miotu byç zwa˝one przynajmniej w 0, 7, 14 i 20 lub 21 dniu powinien mieç charakter losowy, je˝eli nie obserwuje cià˝y, apodczas laktacji wtych samych dniach, wktósi´ znaczàcych ró˝nic w masie cia∏a lub wyglàdzie rych odbywa si´ wa˝enie m∏odych, oraz w dniu w obr´bie miotu. W przypadku zaobserwowania ta- uÊmiercenia zwierzàt. Obserwacje te powinny byç zakich ró˝nic wybrani powinni byç najlepsi przedstawi- pisywane dla ka˝dego doros∏ego zwierz´cia oddzielciele z ka˝dego miotu. Najlepiej opieraç si´ w tym nie. W okresie przed kojarzeniem i podczas cià˝y mieprzypadku na zapisach masy cia∏a, ale w∏aÊciwszym rzone powinno byç spo˝ycie paszy przynajmniej wodmo˝e byç wybór w oparciu o wyglàd. Potomstwo F1 st´pach tygodniowych. Je˝eli badana substancja ponie powinno byç kojarzone, a˝ do osiàgni´cia pe∏nej dawana jest wwodzie, to spo˝ycie wody powinno byç dojrza∏oÊci p∏ciowej. mierzone przynajmniej w odst´pach tygodniowych.

1.5.3. Cykl rujowy analiza ruchliwoÊci (zobacz pozycje 5, 6, 7, 8, 9 i10 pi- Êmiennictwa), to wyliczenie ruchliwoÊci zale˝y od pro- D∏ugoÊç cyklu rujowego i jego normalnoÊç ocenia gów Êredniej pr´dkoÊci wyznaczonych przez operatosi´ u samic P i F1 przez rozmazy pochwowe wykony- ra oraz prostoliniowoÊci lub indeksu liniowoÊci. Je˝eli wane przed kojarzeniem i opcjonalnie podczas koja- próbki sà filmowane (zobacz pozycja 11 piÊmiennicrzenia, dopóki nie nastàpi skojarzenie. Podczas pobie- twa), lub obrazy zapisywane sà w inny sposób w czarania komórek pochwowych/szyjki macicy nale˝y byç sie sekcji to ocenia si´ jedynie grup´ kontrolnà i gruostro˝nym, by nie podra˝niç b∏ony Êluzowej i w na- p´ samców PiF1 otrzymujàcych substancje wnajwy˝- st´pstwie nie sprowokowaç cià˝y urojonej (zobacz po- szej dawce, je˝eli nie obserwuje si´ skutków zwiàzazycja 1 piÊmiennictwa). nych z nara˝aniem; je˝eli takie skutki istniejà, to zwierz´ta otrzymujàce substancje wni˝szych dawkach tak- 1.5.4. Parametry nasienia ˝e muszà byç analizowane. W przypadku braku filmowania lub zapisu cyfrowego podczas sekcji powinny W czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia u wszyst- byç analizowane wszystkie próbki wszystkich grup. kich samców P oraz F1 nale˝y zapisaç mas´ jàder i najàdrzy. Do badaƒ histopatologicznych nale˝y za- Nale˝y wykonaç morfologicznà analiz´ próbki nachowaç po jednym z tych organów (zobacz pkt 1.5.7 sienia najàdrza (lub nasieniowodu). Nasienie (przynaji pkt1.5.8.1). Pozosta∏e jàdra i najàdrza uzyskane mniej 200 na próbk´) powinno si´ badaç w postaci z przynajmniej 10 zwierzàt z ka˝dej grupy samców utrwalonych mokrych preparatów (zobacz pozycja 12 P i F1 powinny byç u˝yte odpowiednio do policzenia piÊmiennictwa) i klasyfikowaç jako normalne lub niespermatyd odpornych na homogenizacj´ i zapasów normalne. Przyk∏adem morfologicznych nieprawid∏onasienia z ogona najàdrza. Od tych samych samców woÊci nasienia jest fuzja, oddzielone g∏ówki, zniepowinno pobraç si´ nasienie zogona najàdrza lub na- kszta∏cone g∏ówki i/lub ogony. Szacowanie powinno sieniowodów w celu oszacowania jego ruchliwoÊci byç dokonane na wybranej podgrupie samców imorfologii. Je˝eli obserwuje si´ skutki zwiàzane zna- wszystkich grup nara˝anych natychmiast po uÊmierra˝aniem lub gdy istniejà dowody z innych badaƒ ta- ceniu zwierzàt lub zwykorzystaniem zapisu cyfrowego kich wp∏ywów na spermatogenez´, to ocena nasienia lub filmowego w póêniejszym czasie. Rozmazy po powinna zostaç dokonana u wszystkich samców utrwaleniu tak˝e mogà byç analizowane w póêniejw ka˝dej grupie nara˝anej; w pozosta∏ych przypad- szym terminie. Wtych przypadkach wpierwszej kolejkach liczenie mo˝e ograniczaç si´ do grupy kontrolnej noÊci analizuje si´ grup´ kontrolnà i grup´ zwierzàt i grupy samców P i F1 otrzymujàcych substancj´ otrzymujàcych substancje w najwy˝szej dawce. Je˝eli w najwy˝szej dawce. nie obserwuje si´ skutków zwiàzanych z nara˝aniem (np. zmiany w morfologii), to zwierz´ta z grup otrzy- Policzona powinna zostaç ca∏kowita liczba sper- mujàcych substancje w innych dawkach nie muszà matyd jàdrowych odpornych na homogenizacj´ oraz byç analizowane. Gdy takie skutki jednak wyst´pujà to liczba nasienia ogona najàdrza (zobacz pozycje 2 i3 pi- analizuje si´ wszystkie zwierz´ta otrzymujàce substan- Êmiennictwa). Zapasy nasienia ogona najàdrza mogà cje we wszystkich dawkach. byç oszacowane na podstawie st´˝enia iobj´toÊci nasienia w zawiesinie stosowanej w oszacowaniach ja- Je˝eli jakikolwiek z powy˝szych parametrów nakoÊciowych, a tak˝e iloÊci nasienia odzyskanego sienia by∏ analizowany jako cz´Êç badaƒ toksycznoÊci w czasie homogenizacji pozosta∏ej tkanki ogona najà- przynajmniej w badaniach 90-dniowych, to niekodrza. Liczenie powinno byç wykonane na wybranej niecznie musi byç on ponownie powtarzany w badagrupie samców ze wszystkich grup nara˝anych na- niu dwupokoleniowym. Zaleca si´ jednak zachowanie tychmiast po uÊmierceniu zwierzàt, chyba ˝e dokony- próbek lub zapisów cyfrowych nasienia pokolewane sà zapisy video lub zapisy cyfrowe lub okazy sà niaP w przypadku koniecznoÊci póêniejszej analizy. zamra˝ane, a analizy sà wykonywane póêniej. W tych przypadkach grupy kontrole i grupy otrzymujàce sub- 1.5.5. Potomstwo stancj´ w najwy˝szej dawce powinny byç oceniane w pierwszej kolejnoÊci. Je˝eli nie obserwuje si´ ˝ad- Ka˝dy miot powinno si´ zbadaç jak najszybciej po nych skutków zwiàzanych znara˝eniem (np. wp∏yw na porodzie (dzieƒ 0 laktacji) wcelu ustalenia liczby ip∏ci liczb´ nasienia, jego ruchliwoÊç i morfologi´), to inne m∏odych, martwych i ˝ywych oraz wystepowania niegrupy nara˝ane nie muszà byç analizowane. Gdy takie prawid∏owoÊci. M∏ode martwe w dniu zerowym, je˝eskutki zostanà jednak zauwa˝one w grupie otrzymujà- li nie uleg∏y maceracji, powinny zostaç przebadane cej substancj´ w najwy˝szej dawce, to wtedy zwierz´- pod kàtem mo˝liwych wad iprzyczyn Êmierci oraz pota otrzymujàce substancj´ w ni˝szych dawkach tak˝e winny byç zachowane (utrwalone). ˚ywe m∏ode pomuszà byç przeanalizowane. winno si´ policzyç izwa˝yç pojedynczo tu˝ po urodzeniu (dzieƒ zerowy laktacji) lub wdniu 1 iwnast´pnych RuchliwoÊç nasienia najàdrza (lub nasieniowodu) dniach, np. w dniu 4, 7, 14 i 21 laktacji. Nieprawid∏opowinno si´ oszacowaç lub filmowaç natychmiast po woÊci fizyczne lub behawioralne zaobserwowane uÊmierceniu zwierzàt. Nasienie pobiera si´, minimali- u samic lub potomstwa powinny byç zanotowane. zujàc uszkodzenia i rozcieƒczajàc do analizy ruchliwo- Êci przy zastosowaniu uznanych metod (zobacz pozy- Fizyczny rozwój potomstwa powinien byç zapisycja 4 piÊmiennictwa). WielkoÊç procentowa ruchliwe- wany g∏ównie na podstawie przyrostu masy cia∏a. Inne go nasienia powinna zostaç okreÊlona subiektywnie parametry fizyczne (np. rozwarcie szpary powiekowej lub obiektywnie. Je˝eli stosowana jest komputerowa i zewn´trznego przewodu s∏uchowego, wyr˝ni´cie si´

z´bów, wzrost w∏osów) mogà dostarczyç dodatkowych Koƒcowe masy cia∏a powinny byç okreÊlone dla informacji, ale dane te powinny byç szacowane wkon- m∏odych pokolenia F1 i F2, które zosta∏y wybrane do tekÊcie dojrzewania p∏ciowego (np.: wiek i masa cia∏a sekcji. Nast´pujàce narzàdy z jednego losowo wybraprzy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia pochwy i rozwoju nego m∏odego/p∏eç/miot (zobacz pkt 1.5.6) powinny gruczo∏u napletkowego) (zobacz pozycja 13 piÊmiennic- byç zwa˝one: mózg, Êledziona i grasica. twa). Badania czynnoÊciowe (aktywnoÊç motoryczna, czynnoÊç sensoryczna, odruchy) pokolenia F1 przed Wyniki sekcji i masy narzàdów powinny byç oszai po odsadzeniu, w szczególnoÊci te zwiàzane z dojrze- cowane w kontekÊcie obserwacji poczynionych w inwaniem p∏ciowym, sà zalecane, je˝eli nie sà cz´Êcià nych badaniach, je˝eli by∏y one prowadzone. osobnych badaƒ. Przy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia pochwy irozwoju gruczo∏u napletkowego powinny byç 1.5.8. Badania histopatologiczne okreÊlone dla odsadzonych m∏odych F1 wybranych do kojarzenia. Odleg∏oÊç anogenitalna powinna zostaç 1.5.8.1. Zwierz´ta rodzicielskie zmierzona w dniu zerowym po urodzeniu u m∏odychF2, je˝eli spowodowane sà przez zmiany w sto- Nast´pujàce narzàdy i tkanki zwierzàt rodzicielsunku p∏ci F1 lub zmiany czasu dojrzewania p∏ciowego. skich (PiF1), bàdê ich reprezentatywne próbki, powinny byç utrwalone i przechowywane w odpowiednim Obserwacje czynnoÊciowe mogà byç pomini´te medium do badaƒ histopatologicznych: wgrupach, które przejawiajà wyraêne objawy szkodliwych skutków (np.: znaczàcy spadek przyrostu masy). — pochwa, macica zszyjkà ijajniki (zachowane wod- Je˝eli badania czynnoÊciowe sà wykonywane, to nie powiednim utrwalaczu), powinny byç one robione na m∏odych wybranych do — jedno jàdro (zachowane w utrwalaczu Bouina lub kojarzenia. porównywalnym), jedno najàdrze, p´cherzyki nasienne, prostata i gruczo∏ koagulujàcy, 1.5.6. Ogólne badania sekcyjne — uprzednio okreÊlone narzàd(y) krytyczne wszyst- Wszystkie zwierz´ta rodzicielskie (PiF1) po zakoƒkich zwierzàt P i F1 wybranych do kojarzenia. czeniu badania i zwierz´ta pad∏e podczas badania lub wszystkie m∏ode, u których stwierdzono zewn´trzne Pe∏ne wyniki badaƒ histopatologicznych zachowanieprawid∏owoÊci lub nietypowe objawy kliniczne, nych narzàdów i tkanek podanych powy˝ej powinny a tak˝e przynajmniej jedno losowo wybrane m∏ozostaç wykonane uwszystkich zwierzàt PiF1 otrzymude/p∏eç/miot zarówno zpokolenia F1, jak iF2 powinno jàcych substancj´ w najwy˝szej dawce i u zwierzàt badaç si´ makroskopowo na wyst´powanie wad rozz grupy kontrolnej wybranych do kojarzenia. Badanie wojowych lub zmian patologicznych. Szczególnà uwajajników zwierzàt P jest badaniem opcjonalnym. Nag´ nale˝y zwracaç na narzàdy uk∏adu rozrodczego. rzàdy wykazujàce zmiany zwiàzane z nara˝eniem po- M∏ode uÊmiercone wsposób humanitarny lub b´dàce winny byç tak˝e zbadane u zwierzàt otrzymujàcych w agonii i m∏ode martwe, je˝eli nie podleg∏y macerasubstancj´ w ni˝szych dawkach tak, aby wspomóc cji, powinny byç przebadane pod wzgl´dem mo˝lioszacowanie NOAEL. Ponadto narzàdy rozrodcze wych wad i/lub przyczyn Êmierci oraz powinny byç zazwierzàt otrzymujàcych ni˝sze dawki, uktórych mo˝na chowane (utrwalone). podejrzewaç zmniejszonà p∏odnoÊç, np. takich, u których nie dochodzi∏o do kojarzenia lub nie dochodzi∏o Macice wszystkich samic pierworódek powinny do zap∏odnienia, lub nie da∏y zdrowego potomstwa byç zbadane w sposób, który nie wyklucza badaƒ hibàdê te˝ uktórych zmieniona by∏a cyklicznoÊç rujowa, stopatologicznych, pod wzgl´dem obecnoÊci i liczby liczba nasienia, jego ruchliwoÊç lub morfologia, pomiejsc zagnie˝d˝eƒ. winny byç poddane badaniom histopatologicznym. Wszystkie zwierz´ta, u których stwierdzono wi´ksze 1.5.7. Masa narzàdów uszkodzenia, takie jak atrofia lub guzy, powinny byç Po zakoƒczeniu badania powinno si´ okreÊliç ma- tak˝e zbadane. s´ cia∏a wszystkich zwierzàt oraz mas´ nast´pujàcych Szczegó∏owe badania histopatologiczne jàder (np.: narzàdów wszystkich zwierzàt rodzicielskich PiF1 (naz zastosowaniem utrwalacza Bouina, techniki parafirzàdy wyst´pujàce parami powinny byç wa˝one pojedynczo): nowej i wykonaniem przekrojów poprzecznych o gruboÊci 4—5 µm) powinny byç przeprowadzone w celu — macica, jajniki, okreÊlenia skutków zwiàzanych z nara˝eniem, takich jak wstrzymane spermatydy, brakujàce komórki na- — jàdra, najàdrza (ca∏e i ogon), b∏onka lub ich rodzaje, wielojàdrowe komórki ogromne lub odpadanie tkanki komórek spermatogenetycz- — prostata, nych wÊwiat∏o przewodu (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Badanie nienaruszonego najàdrza powinno — p´cherzyki nasienne z gruczo∏ami koagulujàcymi i ich p∏yny oraz prostatà (razem), sk∏adaç si´ z badania jego g∏owy, trzonu i ogona, co mo˝e byç osiàgni´te w badaniu przekroju pod∏u˝ne- — mózg, wàtroba, nerki, Êledziona, przysadka, gru- go. Najàdrze powinno byç przebadane pod wzgl´dem czo∏y tarczycowy i nadnercza oraz znane narzàdy infiltracji leukocytów, zmian wyst´pujàcych w typach krytyczne. komórek, rodzajów komórek niew∏aÊciwych oraz fago-

cytozy nasienia. Barwienie PAS i hematoksylinà mo˝e nale˝y powiàzanie, lub jego brak, pomi´dzy dawkà babyç stosowane w badaniu narzàdów rozrodczych danej substancji i obecnoÊcià lub nieobecnoÊcià, wysamców. st´powaniem i nasileniem nieprawid∏owoÊci, w tym powa˝nych uszkodzeƒ zidentyfikowanych organów Jajnik po okresie laktacji powinien zawieraç pier- krytycznych, zmienionà p∏odnoÊç, nieprawid∏owoÊci wotne i wzrastajàce p´cherzyki, a tak˝e du˝e cia∏ka kliniczne, zmienionà wydajnoÊç reprodukcyjnà i liczb´ ˝ó∏te laktacji. Badanie histopatologiczne powinno wy- miotów, zmiany masy cia∏a, wp∏ywy na ÊmiertelnoÊç kryç jakoÊciowe niedobory populacji p´cherzyków iinne skutki dzia∏ania toksycznego. Podczas oszacowapierwotnych. IloÊciowe oszacowanie p´cherzyków nia wyników powinno wziàç si´ pod uwag´ w∏aÊciwopierwotnych powinno byç przeprowadzone dla sa- Êci fizykochemiczne badanej substancji oraz, je˝eli domicF1; liczba zwierzàt, wybór przekrojów jajnika oraz st´pne, to tak˝e dane otoksykokinetyce. rozmiar próbki powinny byç statystycznie odpowiednie do zastosowanej procedury oszacowania. Dla po- W∏aÊciwie przeprowadzone badanie toksycznoÊci równania jajników nara˝onych i kontrolnych badanie reprodukcyjnej powinno umo˝liwiç przeprowadzenie powinno zawieraç policzenie p´cherzyków pierwot- wzadowalajàcy sposób oszacowania poziomu bez winych, które mogà byç liczone wspólnie z ma∏ymi p´- docznych skutków oraz umo˝liwiç zrozumienie szkocherzykami wzrastajàcymi (zobacz pozycje 15, 16, 17, dliwych wp∏ywów na rozmna˝anie, cià˝´, laktacj´, roz- 18 i 19 piÊmiennictwa). wój poporodowy, w tym wzrost i rozwój p∏ciowy. 1.5.8.2. M∏ode odsadzone 2.3. Interpretacja wyników Nietypowo wyglàdajàce tkanki i narzàdy krytyczne Badanie toksycznoÊci w teÊcie dwupokoleniowym wszystkich m∏odych, u których wystàpi∏y nieprawid∏o- ma dostarczyç informacji na temat wp∏ywów powtawoÊci zewn´trzne lub nietypowe objawy kliniczne, atak- rzanego nara˝enia na substancj´ podczas wszystkich ˝e przynajmniej od jednego losowo wybranego m∏ode- faz cyklu reprodukcyjnego. W szczególnoÊci badanie go/p∏eç/miot z pokolenia F1 i F2, które nie zosta∏o wyto dostarcza informacji o parametrach reprodukcji, brane do kojarzenia, powinny byç utrwalone izachowarozwoju, wzrostu iprze˝ywalnoÊci potomstwa. Wyniki ne wodpowiednim medium do badaƒ histopatologiczbadania powinny byç interpretowane w po∏àczeniu nych. Pe∏na charakterystyka histopatologiczna zachoz wynikami badaƒ podprzewlek∏ych, przedporodowanej tkanki powinna byç wykonana ze szczególnym wych rozwojowych, toksykokinetycznych i innych donaciskiem po∏o˝onym na narzàdy uk∏adu rozrodczego. st´pnych. Wyniki niniejszego badania mogà byç stosowane w szacowaniu potrzeby dalszych badaƒ sub- 2. WYNIKI stancji chemicznej. Ekstrapolacja uzyskanych wyników na cz∏owieka jest wiarygodna tylko w ograniczo- 2.1. Opracowanie wyników nym stopniu. Najlepiej stosowaç je do dostarczania informacji o dopuszczalnym nara˝eniu cz∏owieka Dane powinny byç zapisywane indywidualnie izeiopoziomie bez widocznych skutków (zobacz pozycje stawiane w formie tabel. Nale˝y wykazaç dla ka˝dej 20, 21, 22 i 23 piÊmiennictwa). badanej grupy i ka˝dego pokolenia liczb´ zwierzàt na poczàtku badania, liczb´ zwierzàt pad∏ych podczas ba- 3. SPRAWOZDANIE dania lub uÊmierconych z powodów humanitarnych, czas Êmierci lub uÊmiercenia, liczb´ zwierzàt p∏od- Sprawozdanie musi zawieraç nast´pujàce infornych, liczb´ samic w cià˝y, liczb´ zwierzàt wykazujàmacje: cych objawy toksycznoÊci, opis zaobserwowanych objawów toksycznoÊci, w tym czas ich pojawienia si´, Badana substancja: trwanie inasilenie objawów, rodzaje zmian histopatologicznych i wszystkie inne znaczàce dane. — stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏a- ÊciwoÊci fizykochemiczne, Dane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà ogólnie uznanà metodà statystycznà; metody staty- — dane identyfikacyjne, styczne powinny byç wybrane jako cz´Êç sk∏adowa uk∏adu doÊwiadczalnego. Do analizowania danych — czystoÊç. stosowane mogà byç modele statystyczne typu dawka-odpowiedê. Sprawozdanie powinno zawieraç NoÊnik (je˝eli by∏ stosowany): szczegó∏owe informacje o metodzie analizy i zastoso- — uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli by∏ inny ni˝ wanym programie komputerowym, tak by niezale˝ny woda. recenzent/statystyk móg∏ odtworzyç przebieg analizy i ponownie jà oszacowaç. Badane zwierz´ta: 2.2. Oszacowanie wyników — gatunek/szczep, Wyniki badania dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç — liczba, p∏eç i wiek zwierzàt, w warunkach testu dwupokoleniowego powinny byç ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych skutków, — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, w tym wyniki sekcji i dane mikroskopowe. Oszacowaç pasza, materia∏ u˝ywany na gniazdo itp.,

— masy cia∏a poszczególnych zwierzàt na poczàtku — czas trwania cià˝y, doÊwiadczenia. — liczba zagnie˝d˝eƒ, cia∏ek ˝ó∏tych i rozmiar miotu, Warunki badania: — liczba zwierzàt ˝ywo narodzonych i strat po za- — uzasadnienie wybranych dawek, gnie˝d˝eniu, — szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substan- — liczba m∏odych z widocznymi nieprawid∏owoÊciacji/przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´˝enie, mi, je˝eli okreÊlona liczba skar∏owacia∏ych to nale- ˝y podaç, — trwa∏oÊç i jednorodnoÊç u˝ywanego preparatu, — dane o rozwoju poporodowym m∏odych, — szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substancji, — dane o obserwacjach czynnoÊciowych u m∏odych i doros∏ych, — przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji z pokarmu/wody pitnej na dawk´ rzeczywistà — statystyczna analiza wyników. (mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje taka koniecznoÊç, Omówienie wyników. — szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej. Wnioski, w tym wartoÊci NOAEL dla skutów dzia- ∏ania na potomstwo i na osobniki doros∏e. Wyniki: 4. PIÂMIENNICTWO — spo˝ycie paszy i,je˝eli dost´pne, to spo˝ycie wody, wykorzystanie paszy (przyrost masy cia∏a na gram 1) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles ands Seasons, In: spo˝ytej paszy) i spo˝ycie materia∏u badanego dla Reproduction In Mammals: I. Germ Cells and Ferzwierzàt PiF1 z wyjàtkiem okresu kojarzenia iprzy- tilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Camnajmniej ostatniej jednej trzeciej okresu laktacji, bridge, New York. — dane o absorpcji (je˝eli dost´pne), 2) Gray L.E. et al. (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alternations of Repro- — dane dotyczàce masy cia∏a zwierzàt P i F1 wybra- ductive Development and Function in the Rat. nych do kojarzenia, Fundamental and Applied Toxicology 12: 92—108. — masa cia∏a m∏odych i liczebnoÊç miotów, 3) Robb G.W. et al. (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and — masa cia∏a przy uÊmierceniu oraz wzgl´dne i bez- Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility wzgl´dne masy narzàdów zwierzàt rodzicielskich, 54: 103—107. — istota, nasilenie i czas trwania obserwacji klinicz- 4) Klinefelter G.R. et al. (1991) The method of Sperm nych (odwracalne czy nie), Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate — czas padni´cia podczas badania lub czy zwierz´ta Administration in the Rat. Reproductive Toxicoloprze˝y∏y do zakoƒczenia badania, gy 5: 39–44. — reakcja toksyczna wed∏ug p∏ci i dawki, w tym in- 5) Seed J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm deksy kojarzenia, p∏odnoÊci, cià˝y, porodu, ˝ywot- Motility, Morphology and Counts in the Rat, RabnoÊci ilaktacji; sprawozdanie powinno wykazywaç bit and Dog: a Consensus Report. Reproductive liczby zastosowane do obliczeƒ tych indeksów, Toxicology 10: 237—244. — skutki toksyczne lub inne na reprodukcj´, potom- 6) Chapin R.E. et al. (1992). Methods for Assessing stwo, wzrost po porodzie itp., Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6: 267—273. — wyniki sekcji, 7) Klinefelter G.R. et al. (1992). Direct effects of Etha- — szczegó∏owy opis wszystkich zmian histopatolo- ne Dimethanesulfonate on Epididymal Function in gicznych, Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13: 409—421. — liczba samic P i F1 o normalnym cyklu rujowym i d∏ugoÊç cyklu, 8) Slott V.L. et al. (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxi- — ca∏kowita liczba nasienia ogona najàdrza, procent cology 5: 449—458. nasienia ruchliwego, procent nasienia normalne- 9) Slott V.L. and Parreault S.D. (1993). Computer-Asgo morfologicznie, procent nasienia w przypadku ka˝dej zidentyfikowanej nieprawid∏owoÊci, sisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using Hamilton-Thorn Motility — czas kojarzenia, w tym liczba dni potrzebnych do Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Acaskojarzenia, demic, Orlando, Florida, pp. 319—333.

10) Toth G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of 17) Manson J.M. and Y.J. Kang (1989). Test Methods Rat Sperm Motility Following Subchronic Epi- for Assessing Female Reproductive and Developchlorhydrin Administration: Methodologic and mental Toxicology. In: Principles and Methods Statistical Consideration. Journal of Andrology in Toxicology, A.W. Hayes (ed.)., Raven, New York. 10:401–415. 18) Smith B.J. et al. (1991). Comparison of Random 11) Working P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Vi- and Serial Sections in Assessment of Ovarian Todeomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. xicity. Reproductive Toxicology 5: 379—383. Journal of Andrology 8: 330—337. 19) Heindel J.J. (1991). Oocyte Quantitation and Ova- 12) Linder R.E. et al. (1992). Endpoints of Spermatoxirian Histology. In: An Evaluation and Interpretacity in the Rat After Short Duration Exposures to tion of Reproductive Endpoints for Human Health Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Risk Assessment, G. Datson and C.A. Kimmel Toxicology 6: 491—505. (eds.) ILSI Press, Washington DC. 13) Korenbrot C.C. et al. (1977). Preputial Separation 20) Thomas J.A. (1991). Toxic Responses of Reproducas an external Sign of Pubertal Development tive System. In: Casarett and Doull’s Toxicology, in the Male Rat. Biological Reproduction 17: M.O. Amdur, J. Doull and C.D. Klaassen (eds.). 298—303. Pergamon, New York. 14) Russell L.D. et al. (1990). Histological and Histopa- 21) Zenick H. and E.D. Clegg (1989). Assessment thological Evaluation of the Testis, Cache River of Male Reproductive Toxicity: ARisk Assessment Press, Clearwater, Florida. Approach. In: Principles and Methods in Toxicolo- 15) Heindel J.J. and R.E. Chapin (eds.) (1993). Part B. gy, A.W. Hayes (ed.)., Raven, New York. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida. 22) Palmer A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel C.A. and F.C. Fraser (eds.), Raven Press, 16) Heindel J.J. et al. (1989). Histological Assessment New York. of Ovarian Follicle Number in Mice as a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the 23) Palmer A.K. (1978). In: Handbook of Teratology, Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum pp. 421—426. Press, New York. Za∏àcznik nr 9 B.42. UCZULANIE SKÓRY: PRÓBA NA MIEJSCOWYM W¢èLE CH¸ONNYM 1. METODA natywna, gdy wyniki pozytywne i negatywne nie wymagajà z regu∏y dalszego potwierdzenia. Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 429 (2002). PMWCh ma pewne zalety zarówno z punktu widzenia post´pu naukowego, jak idobrostanu zwierzàt. 1.1. Wst´p W metodzie tej bada si´ faz´ indukcji uczulania skóry iuzyskuje iloÊciowe dane przydatne wszacowaniu za- Próba na Miejscowym W´êle Ch∏onnym (PMWCh) le˝noÊci dawka-odpowiedê. Szczegó∏y walidacji zosta∏a wystarczajàco uwierzytelniona i zaakceptowa- PMWCh i przeglàd towarzyszàcych prac opublikowana, tak aby przyjàç jà jako nowà metod´ badawczà no w piÊmiennictwie (zobacz pozycje 5, 6, 7 i 8 pi- (zobacz pozycje 1, 2 i 3 piÊmiennictwa). Jest to druga Êmiennictwa). Ponadto nale˝y odnotowaç, ˝e substanmetoda s∏u˝àca ocenie potencja∏u dzia∏ania uczulajà- cje dzia∏ajàce ∏agodnie/umiarkowanie uczulajàco, któcego substancji chemicznych na skór´ zwierzàt. Inna re sà zalecane jako odpowiednie do kontroli pozytywmetoda opiera si´ na badaniu na Êwinkach morskich, nej wmetodach badaƒ na Êwinkach morskich, równie˝ adok∏adniej jest to test maksymalizacji (B.6) itest Bu- sà odpowiednie w PMWCh (zobacz pozycje 6, 8 i 9 piehlera (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa). Êmiennictwa). PMWCh jest metodà alternatywnà dla wykrywania PMWCh jest metodà in vivo i w konsekwencji nie substancji chemicznych dzia∏ajàcych uczulajàco na eliminuje stosowania zwierzàt w ocenie kontaktowej skór´ lub dla potwierdzenia, ˝e substancje chemiczne aktywnoÊci uczulajàcej. Potencjalnie mo˝e jednak nie posiadajà znaczàcego potencja∏u wywo∏ujàcego zmniejszyç liczb´ zwierzàt potrzebnych do osiàgni´cia uczulanie skóry. Nie oznacza to, ˝e wka˝dym przypad- tego celu. Ponadto PMWCh stwarza znacznie ∏agodku mo˝na stosowaç PMWCh zamiast badaƒ przepro- niejsze warunki, w jakich zwierz´ta sà stosowane wadzanych na Êwinkach morskich, ale raczej, ˝e próba wkontaktowym badaniu uczulenia. PMWCh opiera si´ ta ma równà wartoÊç imo˝e byç stosowana jako alter- na immunologicznych zjawiskach stymulowanych

przez substancje chemiczne w fazie indukcyjnej uczu- ciem podawania substancji w celu aklimatyzacji do lania. W przeciwieƒstwie do badaƒ na Êwinkach mor- warunków laboratoryjnych. Przed rozpocz´ciem doskich PMWCh nie wymaga wywo∏ywania reakcji nad- Êwiadczenia nale˝y sprawdziç wszystkie zwierz´ta, dla wra˝liwoÊci skórnej. Ponadto PMWCh nie wymaga upewnienia si´, czy nie posiadajà widocznych uszkostosowania adjuwanta, tak jak w metodzie maksyma- dzeƒ skóry. lizacji na Êwinkach morskich. Dlatego PMWCh zmniejsza obcià˝enie zwierzàt. Pomimo zalet PMWCh w po- 1.3.2. Warunki badania równaniu do tradycyjnej metody na Êwinkach morskich, istniejà jednak pewne ograniczenia zmuszajàce 1.3.2.1. Zwierz´ta doÊwiadczalne do zastosowania tradycyjnej metody zÊwinkami morskimi (np. fa∏szywie negatywne wyniki dla niektórych Wtym badaniu gatunkiem zwyboru jest mysz. Nametali w PMWCh, fa∏szywie pozytywne wyniki z nie- le˝y u˝yç do badaƒ samice myszy szczepu CBA/Ca lub którymi substancjami dra˝niàcymi skór´) (zobacz po- CBA/J, które sà dziewicze inieci´˝arne. Przy rozpocz´- zycja 10 piÊmiennictwa). ciu badania zwierz´ta powinny byç w wieku 8—12 tygodni, a ró˝nica w masie cia∏a zwierzàt powinna byç Zobacz tak˝e Wprowadzenie cz´Êç B. jak najmniejsza i nie przekraczaç 20 % Êredniej masy. Mo˝na u˝ywaç innych szczepów isamców, gdy sà wy- 1.2. Zasada metody badawczej starczajàce dane dla wykazania, ˝e nie istniejà istotne specyficzne ró˝nice w odpowiedzi w PMWCh zale˝ne od szczepu i/lub p∏ci. Zasadà le˝àcà u podstaw PMWCh jest to, ˝e substancje uczulajàce pobudzajà pierwotne namna˝anie 1.3.2.2. Sprawdzenie wiarygodnoÊci si´ limfocytów w w´êle ch∏onnym poddanemu miejscowemu dzia∏aniu substancji chemicznej. Namna˝a- Do wykazania w∏aÊciwego przeprowadzenia próby nie to jest proporcjonalne do podanej dawki (i do poi kompetencji laboratorium do prawid∏owego wykotencja∏u alergenu) i daje prosty sposób otrzymania nania doÊwiadczenia stosuje si´ kontrol´ pozytywnà. obiektywnego, iloÊciowego pomiaru uczulenia. Kontrola pozytywna powinna daç wPMWCh pozytyw- W PMWCh namna˝anie to wycenia si´ jako zale˝noÊç nà odpowiedê na poziomie nara˝enia, dla którego dawka-odpowiedê, a namna˝anie w grupach nara˝aprzewiduje si´ wzrost wskaênika stymulacji (WS) >3 nych porównuje si´ znamna˝aniem wgrupie kontrolwstosunku do kontroli negatywnej. Dawk´ wkontroli nej znoÊnikiem. Oznaczany jest stosunek namna˝ania pozytywnej nale˝y dobraç tak, by indukcja by∏a wyraêwgrupach nara˝anych igrupie kontrolnej, który nazyna, lecz nie nadmierna. Zalecanymi substancjami sà wany jest Wskaênikiem Stymulacji (WS). Aby badana aldehyd heksylocynamonowy (No CAS 101-86-1, No substancja mog∏a byç oceniona jako potencjalnie EINECS 202-983-3) i merkaptobenzotiazol (No CAS uczulajàca skór´, musi on wynosiç przynajmniej trzy. 149-30-4, No EINECS 205-736-8). W okreÊlonych wa- W opisanej metodzie do pomiarów namna˝ania si´ runkach, po odpowiednim uzasadnieniu, mo˝na u˝yç komórek stosuje si´ substancje znaczone radioaktywinnych substancji kontrolnych spe∏niajàcych powy˝- nie. Mo˝na jednak stosowaç inne sposoby do szacosze kryteria. Kontrola pozytywna wymagana jest zawania namna˝ania si´ komórek, pod warunkiem ˝e zwyczaj w ka˝dym doÊwiadczeniu, lecz mogà byç syjest to umotywowane i znajduje odpowiednie popartuacje, gdy laboratoria badawcze posiadajà dane arcie naukowe, zawierajàce pe∏ne cytowania i opis mechiwalne dotyczàce kontroli pozytywnej, wskazujàce todologii. na sta∏oÊç zadowalajàcych reakcji przez okres szeÊciu miesi´cy lub d∏u˝szy. W takich sytuacjach rzadsze 1.3. Opis metody badawczej sprawdzanie za pomocà kontroli pozytywnej jest w∏a- Êciwe, lecz w odst´pach nie d∏u˝szych ni˝ 6 miesi´cy. 1.3.1. Przygotowania Chocia˝ pozytywnà kontrol´ substancji nale˝y sprawdzaç w noÊniku, o którym wiadomo, ˝e wywo∏uje sta- 1.3.1.1. Warunki przetrzymywania ikarmienia zwierzàt ∏à odpowiedê (np. aceton: oliwa z oliwek), to mogà wystàpiç szczególne okolicznoÊci okreÊlone w odr´b- Temperatura wpomieszczeniach doÊwiadczalnych nych przepisach, w których b´dzie równie˝ konieczne powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna poprzebadanie wniestandardowym noÊniku (odpowiedwinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odnia formulacja o znaczeniu klinicznym/chemicznym). chyleniach mi´dzy 30 % a70 % (wy˝sza wartoÊç jedy- W takich sytuacjach nale˝y przebadaç mo˝liwà intenie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stoso- rakcj´ pozytywnej kontroli z niekonwencjonalnym nowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 go- Ênikiem. dzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapew- 1.3.2.3. Liczba zwierzàt, poziom dawkowania i wybór niç nieograniczony dost´p do wody. noÊnika 1.3.1.2. Przygotowanie zwierzàt Nale˝y stosowaç minimum po cztery zwierz´ta w grupach nara˝anych i co najmniej trzy st´˝enia ba- Zwierz´ta nale˝y dobieraç losowo, znakowaç dla danej substancji, grup´ kontroli negatywnej otrzymuumo˝liwienia indywidualnej identyfikacji (lecz nie za jàcej jedynie noÊnik badanej substancji igrup´ kontropomocà jakiegokolwiek znakowania uszu), przetrzy- li pozytywnej, o ile stosowne. W przypadkach, w któmywaç wklatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´- rych wycenia si´ dane indywidualnych zwierzàt, nale-

˝y stosowaç minimum pi´ç zwierzàt w grupie. Zwie- urydyny i 10–5 M fluorodeoksyurydyny wszystkim rz´ta z grup kontrolnych nale˝y traktowaç w ten sam myszom do ˝y∏y ogonowej. sposób jak zgrup nara˝onych, z wyjàtkiem podawania Po pi´ciu godzinach zwierz´ta nale˝y uÊmierciç. badanej substancji. Zwierz´tom nara˝onym na substancj´ nale˝y Dobór dawek i noÊnika nale˝y opieraç o zalecenia z ka˝dego ucha wyciàç przyuszne w´z∏y ch∏onne z publikacji (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Dawki izanurzyç wPBS. Zka˝dej badanej grupy (badanie w sposób grupowy) alternatywnie nale˝y wyciàç nale˝y dobraç zserii st´˝eƒ 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, pary w´z∏ów ch∏onnych od ka˝dego zwierz´cia 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Gdy sà dost´pne wyniki i zanurzyç w PBS osobno dla ka˝dego zwierz´cia ostrej toksycznoÊci skórnej i dra˝nienia skóry, nale˝y (sposób indywidualny). Szczegó∏y i wykresy idenje braç pod uwag´ przy doborze tych trzech kolejnych tyfikacji w´z∏ów i analizy mo˝na znaleêç w za∏àczst´˝eƒ tak, by przy nara˝eniu na najwy˝sze st´˝enie niku Ido pozycji piÊmiennictwa (zobacz pozycja 10 uniknàç toksycznoÊci ogólnoustrojowej i nadmiernepiÊmiennictwa). go miejscowego podra˝nienia skóry (zobacz pozycje 2 i 11 piÊmiennictwa). 1.3.3.2. Przygotowanie zawiesiny komórek NoÊnik nale˝y dobieraç, uwzgl´dniajàc maksymal- Zawiesiny komórek w´z∏a ch∏onnego otrzymane ne st´˝enia substancji stosowanej wbadaniu imaksyze zwierzàt, badanych zarówno grupowo lub jak i od malnà rozpuszczalnoÊç, by mo˝na uzyskaç roztwopojedynczych zwierzàt, przygotowuje si´ poprzez ∏ary/zawiesiny odpowiednie dla podawania badanej godne mechaniczne rozdrobnienie na nierdzewnej substancji. Zaleca si´ noÊniki w nast´pujàcej kolejnosiatce stalowej o oczkach 200 µm. Komórki w´z∏a Êci: aceton/oliwa zoliwek (4:1 v/v), dimetyloformamid, ch∏onnego przemywa si´ dwukrotnie PBS dodanym keton metyloetylowy, propylenoglikol idimetylosulfow nadmiarze i wytràca 5 % kwasem trichlorooctotlenek (zobacz pozycje 2 i 10 piÊmiennictwa), ale mowym (TCA) w temp. 4 °C przez 18 godzin (zobacz pogà byç równie˝ stosowane inne noÊniki, o ile dyspozycja 2 piÊmiennictwa). Granulki nale˝y ponownie zanuje si´ o nich odpowiednià wiedzà naukowà. W niewiesiç w1 ml kwasu trichlorooctowego iprzenieÊç do których przypadkach konieczne mo˝e byç u˝ywanie, fiolki scyntylacyjnej zawierajàcej 10 ml p∏ynu scyntylajako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika stosowanecyjnego dla zliczenia 3H, lub przenieÊç bezpoÊrednio go jako materia∏ do formulacji handlowej badanej do probówki pomiarów gamma dla zliczenia 125I. substancji lub rozpuszczalnika wa˝nego z klinicznego punktu widzenia. W szczególnoÊci nale˝y zapewniç, 1.3.3.3. Oznaczanie namna˝ania si´ komórek (radioakaby materia∏y hydrofilne by∏y podawane zzastosowatywnoÊç zwiàzana) niem noÊnika, który zwil˝a skór´ i nie sp∏ywa natychmiast. Dlatego nale˝y unikaç stosowania jedynie wod- Zwiàzanie 3H-metylotymidyny mierzy si´ za pomonych noÊników. cà licznika β-scyntylacyjnego jako liczb´ rozpadów na minut´. Zwiàzanie 125 I-jododeoksyurydyny mierzy si´ 1.3.3. Sposób post´powania za pomocà licznika 125I scyntylacyjnego i wyra˝a si´ równie˝ w postaci liczby rozpadów na minut´. W za- 1.3.3.1. Plan doÊwiadczenia le˝noÊci od stosowanego sposobu badania wiàzania wyra˝a si´ wpostaci liczby rozpadów na minut´/nara- Plan doÊwiadczenia jest nast´pujàcy: ˝ana grupa (sposób grupowy) lub rozpad na minu- — Dzieƒ 1: t´/zwierz´ (sposób indywidualny). Ustalanie i zapisywanie indywidualnej masy cia∏a 1.3.3.4. Obserwacje dla ka˝dego zwierz´cia. Nanoszenie 25 µl odpowiedniego roztworu badanej substancji, samego 1.3.3.4.1. Obserwacje kliniczne noÊnika lub kontroli pozytywnej (je˝eli sà stosowane) na grzbietowà stron´ ka˝dego ucha zwierz´cia. Zwierz´ta nale˝y obserwowaç starannie raz w ciàgu dnia pod kàtem objawów klinicznych albo miejsco- — Dzieƒ 2 i 3: wego dra˝nienia w miejscach podania lub toksyczno- Powtórzyç procedur´ nanoszenia jak w dniu 1. Êci ogólnoustrojowej. Wszystkie obserwacje ∏àcznie z zapisami dla pojedynczych zwierzàt nale˝y systema- — Dzieƒ 4 i 5: tycznie zapisywaç. Brak nara˝enia. 1.3.3.4.2. Masa cia∏a — Dzieƒ 6: Jak podano wpkt 1.3.3.1, masy cia∏a pojedynczych Zapisaç mas´ cia∏a ka˝dego zwierz´cia. Ka˝dej zwierzàt nale˝y ustalaç na poczàtku doÊwiadczenia myszy, której podawano substancj´, imyszy zgru- i przed planowym uÊmierceniem zwierzàt. py kontrolnej wstrzyknàç do ˝y∏y ogonowej po 250 µl roztworu buforu fosforanowego (PBS) za- 1.3.4. Obliczanie wyników wierajàcego 20 µCi (7,4e+8 Bq) 3H-metylotymidyny. Alternatywnie wstrzyknàç 250 (l roztworu PBS Wyniki nale˝y wyraziç wformie Wskaênika Stymuzawierajàcego 2 µCi (7,4e+7 Bq) 125I-jododeoksy- lacji (WS). Gdy stosuje si´ sposób grupowy, WS otrzy-

muje si´ dzielàc, zwiàzanà radioaktywnoÊç dla ka˝dej NoÊnik: nara˝anej grupy przez przy∏àczonà radioaktywnoÊç grupy kontrolnej z noÊnikiem; to daje Êredni WS. Gdy — dane identyfikacyjne (stopieƒ czystoÊci; st´˝enie, stosuje si´ sposób indywidualny, WS oblicza si´, dzie- o ile dotyczy; stosowana obj´toÊç), làc Êredni rozpad na minut´/mysz w ramach ka˝dej — uzasadnienie wyboru noÊnika. nara˝anej grupy i grup´ pozytywnej kontroli przez Êredni rozpad na minut´/mysz dla grupy kontrolnej rozpuszczalnik/noÊnik. Âredni WS dla grup kontrol- Zwierz´ta doÊwiadczalne: nych z noÊnikiem wynosi wtedy 1. — szczep stosowanych myszy, Zastosowanie sposobu indywidualnego do wyli- — stan mikrobiologiczny zwierzàt, je˝eli jest znany, czenia WS umo˝liwia przeprowadzenie statystycznej analizy wyników. Przy wyborze odpowiedniej metody — liczba, wiek i p∏eç zwierzàt, analizy statystycznej badacz musi byç Êwiadomy mo˝- liwych nierównoÊci wariancji i innych zwiàzanych — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, z tym problemów, co mo˝e wymagaç przetworzenia pasze itd. danych lub zastosowania nieparametrycznej analizy statystycznej. Za pomocà odpowiedniego sposobu in- Warunki przeprowadzania badania: terpretacji nale˝y oceniç wszystkie indywidualne dane nara˝anych i kontrolnych zwierzàt i dopasowaç na tej — szczegó∏y przygotowania badanej substancji i jej podstawie stosownà krzywà zale˝noÊci dawka-odpopodawanie, wiedê, bioràc pod uwag´ przedzia∏y ufnoÊci (zobacz pozycje 8, 12 i 13 piÊmiennictwa). Jednak badacz mu- — uzasadnienie wyboru dawek (∏àcznie z wynikami si uwa˝aç na mo˝liwe skrajne reakcje indywidualnych testu poszukiwania zakresu dawek, je˝eli prowazwierzàt wewnàtrz grup, co mo˝e wymagaç stosowadzono); stosowane st´˝enia badanej substancji nia alternatywnych miar reakcji (np. raczej mediany, i noÊnika i ogólna iloÊç podawanej substancji, a nie Êredniej) lub eliminowania skrajnych danych. — szczegó∏y jakoÊci paszy i wody (∏àcznie z typem Proces podejmowania decyzji odnoÊnie pozytywpaszy i êród∏em dostawy, êród∏o wody). nej reakcji obejmuje WS ≥3, ∏àcznie zrozwa˝eniem reakcji dawka-odpowiedê, i, o ile stosowne, istotnoÊci Sprawdzenie wiarygodnoÊci: statystycznej (zobacz pozycje 3, 6, 8, 12 i 14 piÊmiennictwa). — podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia Je˝eli zachodzi potrzeba objaÊnienia otrzymanych wiarygodnoÊci, ∏àcznie z informacjami o substanwyników, nale˝y zwróciç uwag´ na ró˝ne w∏aÊciwoÊci cji, st´˝eniu i stosowanym noÊniku, badanej substancji, wtym strukturalne podobieƒstwo — równolegle uzyskane i/lub archiwalne pozytywne do znanych substancji uczulajàcych skór´, czy zdoli negatywne dane kontrolne dla badajàcego labonoÊç powodowania silnego dra˝nienia skóry i rodzaj reakcji dawka-odpowiedê. Te i inne okolicznoÊci dys- ratorium. kutowane sà szczegó∏owo w innym miejscu (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Wyniki: 2. WYNIKI — indywidualne masy cia∏a zwierzàt na poczàtku nara˝enia i przy planowanym ich uÊmiercaniu; Wyniki nale˝y zestawiç w formie tabel, wykazujàc Êrednie i pojedyncze wartoÊci rozpadu na minut´ — tabela z podaniem wartoÊci Êredniej/mediany i wskaêniki stymulacji dla ka˝dej badanej grupy (sposób grupowy) lub indywidualnych (sposób in- (w tym grupa kontrolna z noÊnikiem). dywidualny) rozpadu na minut´, jak równie˝ zakres wartoÊci dla obu sposobów iwskaêników sty- 3. SPRAWOZDANIE mulacji dla ka˝dej badanej grupy (∏àcznie zkontrolà noÊnika), Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje: — analiza statystyczna, gdy by∏a stosowana, Badana substancja: — czas wystàpienia i objawy toksyczne, w∏àcznie z podra˝nieniem skóry w miejscu na∏o˝enia, gdy — dane identyfikacyjne (np. numer CAS (je˝eli jest wystàpi∏o, dla ka˝dego zwierz´cia. dost´pny); êród∏o pochodzenia; stopieƒ czystoÊci; znane zanieczyszczenia; numer serii), Dyskusja wyników: — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. — krótki komentarz do wyników, do analizy zale˝nolotnoÊç, trwa∏oÊç, rozpuszczalnoÊç), Êci dawka-odpowiedê i analizy statystycznej, gdy — w przypadku mieszanin sk∏ad i zawartoÊç sk∏adni- by∏y stosowane, zwnioskiem czy badana substanków. cja mo˝e byç uznana za uczulajàcà skór´.

4. PIÂMIENNICTWO method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49—59. 1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and 9) Dearman, R.J., Hilton, J, Evans, P., Harvey, P., Banew directions: A commentary. Food and Chemi- sketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stabical Toxicology, 30, 165—169. lity of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicolo- 2) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Bagy, 18, 281—4. sketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 10) National Institute of Environmental Health Scien- 13—31. ces (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact 3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., dermatitis potential of chemicals/compounds: The Ryan, C.A. Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., results of an independent peer review evaluation Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). coordinated by the Interagency Coordinating Assessment of the skin sensitisation potential of Committee on the Validation of Alternative Metopical medicaments using the local lymph node thods (ICCVAM) and the National Toxicology Proassay: An interlaboratory exercise. Journal of gram Center for the Evaluation of Alternative Toxi- Toxicology and Environmental Health, 53,563—79 cological Methods (NICETAM). NIH Publication (1998). No: 99—4494, Research Triangle Park, N.C. 4) OECD (1992). Guideline 406 Skin Sensitisation. (http://iccvam.niehs.nih.gov.). 5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The lo- 11) OECD (2002). Guideline 404 Acute Dermal Irritacal lymph node assay: status of validation. Food tion/Corrosion. and Chemical Toxicology, 34, 999—1002. 12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W., Lees, D., 6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Lo- Kimber, I. and Botham, P.A. (1993). Results with veless, S.E. (1996) The local lymph node assay OECD recommended positive control sensitisers in Aviable alternative to currently accepted skin sen- the maximisation. Buehler and local lymph node sitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63—67. 985—997. 13) Basketter, D.A., Lea, L.J., Dickens, A., Briggs, D., 7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. Pate, I., Dearman, R.J., Kimber, I. (1999). Acompa- (1998). Strategies for identifying false positive re- rison of statistical approaches to the derivation of sponses in predictive sensitisation tests. Food and EC3 values from local lymph node assay dose re- Chemical Toxicology. (in press) 36, 327—33. sponses. J. Appl. Toxicology, 19, 261—266. 8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vande- 14) Basketter, D.A., Blaikie, L., Dearman, R.J., Kimber, I., briel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Harvey, P., Evans, P., Whimethod for assessing the sensitising potency of te, I.R. and Rycroft, R.T.G. (2000). Use of local lymph low molecular weight chemicals using a local node assay for the estimation of relative contact allymph node assaay: employment of a regression lergenic potency. Contact Dermatitis, 42, 344—48. Za∏àcznik nr 10 B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNOÂCI NA GRYZONIACH 1. METODA opartych o niniejszà metod´ badawczà zaleca si´ korzystanie z Dokumentu Przewodniego OECD dotyczà- Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- cego strategii imetod badawczych neurotoksycznoÊci sanej w Wytycznej OECD nr 424 (1997). (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Jest to szczególnie wa˝ne, gdy dokonuje si´ modyfikacji obserwacji ipro- Badanie przeprowadzone zgodnie z niniejszà me- cedur badawczych zalecanych przy rutynowym stosotodà badawczà ma na celu dostarczenie informacji ko- waniu niniejszej metody. Dokument Przewodni zosta∏ niecznych dla potwierdzenia lub dalszego scharakte- przygotowany dla u∏atwienia wyboru innych procedur ryzowania potencjalnej neurotoksycznoÊci substancji badawczych stosowanych w szczególnych okolicznochemicznych u doros∏ych zwierzàt. Mo˝e ona byç ∏à- Êciach. czona zinnymi metodami badawczymi przy powtarzanym podawaniu dawki bàdê te˝ mo˝e byç wykonywa- Oszacowanie neurotoksycznoÊci rozwojowej nie na jako oddzielne badanie. W projektowaniu badaƒ jest przedmiotem niniejszej metody.

1.1. Wst´p sycznych zalicza si´ procedury histopatologiczne i behawioralne, które mogà byç dalej uzupe∏nione przez W szacowaniu i ocenie toksycznego charakteru badania elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (zosubstancji chemicznych wa˝ne jest, aby wziàç pod bacz pozycje 1, 2, 3 i 4 piÊmiennictwa). uwag´ potencjalne wystàpienie skutków neurotoksycznych. Ju˝ metoda badawcza przy powtarzanym Substancje neurotoksyczne mogà dzia∏aç na wiele podawaniu dawki uwzgl´dnia obserwacje pod kàtem miejsc w obr´bie uk∏adu nerwowego za pomocà wiepotencjalnej neurotoksycznoÊci. Niniejsza metoda ba- lu mechanizmów. ˚aden pojedynczy zestaw testów dawcza mo˝e byç stosowana w planowaniu badania nie jest wstanie wpe∏ni oszacowaç potencja∏u neuromajàcego na celu uzyskanie dalszych informacji, bàdê toksycznego wszystkich substancji chemicznych, dlaich potwierdzeniu, co do skutków neurotoksycznych tego konieczne mo˝e byç zastosowanie innych badaƒ obserwowanych w badaniach toksycznoÊci przy po- in vivolub in vitrospecyficznych dla rodzaju obserwowtarzanym nara˝eniu. Uwzgl´dnienie jednak mo˝liwej wanej lub przewidywanej neurotoksycznoÊci. neurotoksycznoÊci pewnych klas substancji chemicznych mo˝e sugerowaç, ˝e jest ona bardziej w∏aÊciwie Niniejsza metoda badawcza mo˝e byç tak˝e stosooszacowana przez niniejszà metod´ bez wczeÊniej- wana w po∏àczeniu z wytycznymi zawartymi w Dokuszych ustaleƒ mo˝liwej neurotoksycznoÊci w bada- mencie Przewodnim OECD na temat strategii i metod niach przy powtarzanym dawkowaniu. Takie rozwa˝a- badawczych neurotoksycznoÊci (zobacz pozycja 1 pinia zawierajà na przyk∏ad: Êmiennictwa), do planowania badaƒ zamierzajàcych dalej charakteryzowaç lub zwi´kszaç czu∏oÊç oceny — obserwacje objawów neurologicznych lub zmian iloÊciowej typu dawka-odpowiedê lub lepiej oszaconeuropatologicznych w badaniach toksycznoÊci waç poziom bez obserwowanego szkodliwego dzia∏ainnych ni˝ te z powtarzanym dawkowaniem lub nia lub uzasadniç znane lub spodziewane zagro˝enia powodowane przez substancj´. Na przyk∏ad mo˝na — strukturalne pokrewieƒstwo lub inne informacje zaplanowaç badanie majàce na celu identyfikacj´ ∏àczàce je ze znanymi substancjami o dzia∏aniu i oszacowanie mechanizmów neurotoksycznych lub neurotoksycznym. uzupe∏niç dane ju˝ istniejàce z podstawowych obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych. Ponadto mogà wystàpiç inne przypadki, gdy zasto- Takie badania nie muszà powtarzaç danych, które bysowanie niniejszej metody badawczej jest w∏aÊciwe; ∏yby wygenerowane z zastosowania standardowych dalsze szczegó∏y mo˝na znaleêç wpiÊmiennictwie (zoprocedur niniejszej metody, je˝eli takie dane ju˝ istniebacz pozycja 1 piÊmiennictwa). jà i nie sà uwa˝ane za niezb´dne do interpretacji wyników badania. Niniejszà metod´ opracowano w taki sposób, aby mog∏a byç przystosowana do spe∏nienia szczególnych Badanie neurotoksycznoÊci, wykonywane osobno potrzeb, potwierdziç specyficznà neurotoksycznoÊç hilub w po∏àczeniu, dostarcza informacji, które mogà: stopatologicznà lub behawioralnà substancji chemicznej, atak˝e dostarczyç charakterystyk´ iocen´ iloÊcio- — stwierdzaç, czy badana substancja dzia∏a na uk∏ad wà reakcji neurotoksycznych. nerwowy wsposób odwracalny lub nieodwracalny, W przesz∏oÊci neurotoksycznoÊç przyrównywano — przyczyniç si´ do charakterystyki zmian w uk∏ado neuropatii obejmujàcej zmiany neuropatologiczne dzie nerwowym towarzyszàcym nara˝eniu na balub zaburzenia neurologiczne, takie jak napad padacz- danà substancj´ i do zrozumienia mechanizmów kowy, parali˝ lub dr˝enie. Chocia˝ neuropatia jest wa˝- le˝àcych u podstaw tych zmian, nym objawem neurotoksycznoÊci to obecnie oczywistym jest, ˝e istnieje wiele innych objawów toksyczno- — okreÊliç zale˝noÊci mi´dzy wielkoÊcià dawki acza- Êci wuk∏adzie nerwowym (np.: utrata koordynacji mo- sem wystàpienia odpowiedzi (reakcji) celem oszatorycznej, os∏abienie czucia, zaburzenia wuczeniu iza- cowania poziomu bez obserwowanego dzia∏ania pami´tywaniu), które nie majà odbicia w neuropatii szkodliwego (stosowanego do okreÊlenia krytelub innych rodzajach badaƒ. riów bezpieczeƒstwa substancji chemicznej). Niniejsza metoda badawcza dotyczàca neurotok- Niniejsza metoda badawcza opiera si´ na podawasycznoÊci przeznaczona jest do wykrywania g∏ównych niu badanej substancji drogà pokarmowà. Inne drogi skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych podawania (np.: przez skór´ lub drogà inhalacyjnà) mou doros∏ych gryzoni. Podczas gdy skutki behawioral- gà byç bardziej w∏aÊciwe, ale mogà wtedy wymagaç ne, nawet pod nieobecnoÊç zmian morfologicznych, modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podamogà odzwierciedlaç szkodliwy wp∏yw na organizm, wania zale˝y od sposobu nara˝enia cz∏owieka idost´pto nie wszystkie zmiany behawioralne sà specyficzne nych informacji toksykologicznych lub kinetycznych. dla uk∏adu nerwowego. Dlatego ka˝da obserwowana zmiana powinna byç oszacowana w po∏àczeniu z da- 1.2. Definicje nymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub biochemicznymi, jak równie˝ wynikami innego rodzaju Szkodliwy skutek: jest ka˝dà zmianà w stosunku badaƒ toksycznoÊci uk∏adowej. Do badaƒ uj´tych do wyjÊciowej zale˝nà od nara˝enia, która zmniejsza w niniejszej metodzie majàcych na celu dostarczenie zdolnoÊç organizmu do prze˝ycia, rozmna˝ania si´ lub charakterystyki i oceny iloÊciowej reakcji neurotok- przystosowania do Êrodowiska.

Dawka:jest iloÊcià podanej substancji. Dawk´ wy- 1.4. Opis metody badawczej ra˝a si´ jako mas´ (np. mg) lub jako mas´ badanej substancji na jednostk´ masy zwierz´cia doÊwiadczal- 1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt nego (np. mg/kg), lub jako sta∏e st´˝enie w paszy. Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ Dawkowanie: jest poj´ciem ogólnym obejmujà- inne gatunki gryzoni równie˝ mogà byç stosowane po cym dawk´, jej cz´stotliwoÊç i czas trwania jej poda- odpowiednim uzasadnieniu. Stosowaç nale˝y powania. wszechnie u˝ywane szczepy laboratoryjne m∏odych, zdrowych zwierzàt. Samice powinny byç dziewicze NeurotoksycznoÊç:jest szkodliwà zmianà wstruk- i nieci´˝arne. Dawkowanie powinno rozpoczàç si´ jak turze lub funkcjonowaniu uk∏adu nerwowego, która najszybciej po odstawieniu nie póêniej ni˝ w wieku wynika z nara˝enia na czynnik biologiczny, chemiczny 6tygodni, aw˝adnym przypadku wwieku ponad 9 tylub fizyczny. godni. Je˝eli jednak niniejsze badanie jest ∏àczone z innymi, to wymagania co do wieku zwierzàt mogà Czynnik neurotoksyczny: to ka˝dy czynnik biolo- ulec pewnym modyfikacjom. Na poczàtku doÊwiadgiczny, chemiczny lub fizyczny posiadajàcy mo˝liwoÊç czenia ró˝nica masy cia∏a nie powinna przekraczaç spowodowania neurotoksycznoÊci. ±20 % Êredniej masy cia∏a ka˝dej p∏ci. Je˝eli doÊwiadczenie krótkoterminowe z powtarzanym dawkowa- NOAEL:skrót dla poziomu dawkowania bez obser- niem prowadzone jest jako wst´p do badania d∏ugowowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy po- terminowego, to w obydwu doÊwiadczeniach nale˝y ziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodli- stosowaç takie same szczepy zwierzàt. wych skutków zwiàzanych z nara˝eniem. 1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt 1.3. Zasada metody badawczej Temperatura wpomieszczeniach doÊwiadczalnych Badana substancja podawana jest drogà pokar- powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna pomowà w szeregu dawek kilku grupom gryzoni labora- winna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchytoryjnych. Wymagane jest powtarzane podawanie da- leniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie wek, a czas dawkowania powinien byç 28-dniowy, podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç podprzewlek∏y (90 dni) lub przewlek∏y (1 rok lub d∏u- sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ˝ej). Procedury przedstawione w niniejszej metodzie ciemnoÊci. Nat´˝enie ha∏asu nale˝y ograniczyç do mibadawczej mogà byç tak˝e wykorzystane do badania nimum. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowaostrej neurotoksycznoÊci. Zwierz´ta sà badane celem na typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç niewykrycia lub scharakteryzowania nieprawid∏owoÊci ograniczony dost´p do wody. Na wybór pokarmu mobehawioralnych i/lub neurologicznych. Rozpi´toÊç ˝e wp∏ywaç koniecznoÊç zapewnienia odpowiedniego zmian behawioralnych, które mogà byç spowodowa- zmieszania badanej substancji, gdy taki jest jej sposób ne przez substancj´ neurotoksycznà, jest okreÊlana podawania. Zwierz´ta mo˝na przetrzymywaç indywiw ka˝dym okresie obserwacji. Pod koniec badania dualnie lub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci. cz´Êç zwierzàt ka˝dej p∏ci z ka˝dej grupy poddaje si´ perfuzji in situ i wykonuje sekcj´ mózgu, rdzenia kr´- 1.4.3. Przygotowanie zwierzàt gowego i nerwów obwodowych. Zdrowe, m∏ode zwierz´ta sà w sposób losowy Gdy doÊwiadczenie jest prowadzone jako samo- przypisywane do grup nara˝anych i kontrolnej. Klatki dzielne badanie s∏u˝àce stwierdzeniu neurotoksyczno- powinny byç umiejscowione w taki sposób, aby zmi- Êci lub charakterystyce skutków neurotoksycznych, to nimalizowaç ewentualne skutki wynikajàce z ich usyzwierz´ta wka˝dej grupie nieu˝yte do perfuzji ibadaƒ tuowania. Zwierz´ta sà jednoznacznie znakowane histopatologicznych (zobacz tabela B.43.1) mogà byç i trzymane w klatkach przez przynajmniej 5 dni przed u˝yte do specyficznych badaƒ neurobehawioralnych, rozpocz´ciem badania celem aklimatyzacji do warunneuropatologicznych, neurochemicznych lub elektro- ków laboratoryjnych (zobacz pozycja 5 piÊmiennicfizjologicznych, które uzupe∏nià dane otrzymane twa). w standardowych badaniach wymaganych przez niniejszà metod´ (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Te 1.4.4. Sposób podawania i przygotowanie dawek dodatkowe procedury mogà byç szczególnie u˝yteczne, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane Niniejsza metoda badawcza przeznaczona jest do skutki wskazujà na specyficzny rodzaj lub cel neuro- podawania badanej substancji drogà pokarmowà. PotoksycznoÊci substancji chemicznej. Pozosta∏e zwie- dawanie drogà pokarmowà mo˝e byç wykonywane za rz´ta mogà byç tak˝e stosowane alternatywnie do pomocà sondy, wpaszy, wodzie pitnej lub kapsu∏kach. oszacowaƒ, takich jak te podane w metodach badaw- Inne sposoby podawania (np. przez skór´ lub drogà czych przy powtarzanym dawkowaniu na gryzoniach. inhalacyjnà) mogà byç stosowane, ale mogà wymagaç modyfikacji stosowanych procedur. Wybór drogi Gdy post´powanie wed∏ug niniejszej metody jest nara˝ania zale˝y od profilu nara˝enia ludzi i dost´p- ∏àczone z post´powaniem wymaganym przez te inne nych informacji toksykologicznych ikinetycznych. Nametody, to wtedy potrzebna jest wystarczajàca liczba le˝y podaç uzasadnienie wyboru drogi nara˝enia iwyzwierzàt, by zapewniç obserwacje w obydwu bada- nikajàce stàd modyfikacje procedur metody badawniach. czej.

Je˝eli to konieczne, to badana substancja mo˝e konania badania i czu∏oÊç stosowanych sposobów byç rozpuszczona lub zawieszona wodpowiednim no- post´powania. Takie dane powinny dostarczaç do- Êniku. W pierwszej kolejnoÊci zaleca si´ stosowanie wodów na zdolnoÊç do wykrywania i iloÊciowej oceroztworów/zawiesin wodnych, a w dalszej kolejnoÊci ny, o ile dotyczy, zmian w ró˝nych parametrach zaleroztworów/zawiesin olejowych (np. w oleju kukury- canych do obserwacji, takich jak objawy autonomiczdzianym) i w koƒcu roztworów/zawiesiny w innych ne, reakcje na bodêce, si∏a uchwytu i aktywnoÊç runoÊnikach. Charakterystyka toksykologiczna noÊnika chowa. Informacje o substancjach, które powodujà powinna byç znana. Ponadto nale˝y uwzgl´dniç nast´- ró˝ne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mogà byç pujàce w∏aÊciwoÊci noÊnika: wp∏ywy noÊnika na ab- stosowane jako kontrola pozytywna, mo˝na znaleêç sorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm i retencj´ bada- wpozycjach od 2 do 9 piÊmiennictwa. Dane archiwalnej substancji, które mogà zmieniç jej charakterystyk´ ne mogà byç stosowane, je˝eli podstawowe aspekty toksykologicznà, wp∏ywy na konsumpcj´ paszy i spo- sposobów post´powania pozostajà takie same. Zale- ˝ycie wody lub stan od˝ywienia zwierzàt. cana jest okresowa aktualizacja danych archiwalnych. Nowe dane wykazujàce ciàg∏à czu∏oÊç sposo- 1.5. Sposoby post´powania bów post´powania powinny byç wygenerowane, gdy jakieÊ podstawowe elementy badania lub sposo- 1.5.1. Liczba i p∏eç zwierzàt bu post´powania zosta∏y zmienione przez laboratorium wykonujàce. Je˝eli badanie wykonywane jest jako oddzielne, to wtedy nale˝y stosowaç przynajmniej 20 zwierzàt 1.5.4. Wybór dawek (10 samic i 10 samców) w ka˝dej grupie nara˝anej i kontroli celem dokonania szczegó∏owych obserwacji Przy doborze poziomu dawek powinny byç brane klinicznych i czynnoÊciowych. Przynajmniej pi´ç sapod uwag´ jakiekolwiek wczeÊniejsze obserwacje mic ipi´ç samców ztych dziesi´ciu samców idziesi´- toksykologiczne i kinetyczne dost´pne dla badanego ciu samic powinno byç poddane perfuzji in situ i u˝yzwiàzku lub materia∏ów podobnych. Najwy˝szy potych do szczegó∏owych badaƒ neurohistopatologiczziom dawkowania nale˝y dobraç w taki sposób, by nych pod koniec doÊwiadczenia. W przypadkach gdy wywo∏aç skutki neurotoksyczne lub wyraêne toksycztylko ograniczona liczba zwierzàt wdanej grupie dawne skutki ogólnoustrojowe. W dalszej kolejnoÊci makowej przejawia oznaki skutków neurotoksycznych, lejàca sekwencja dawek powinna byç dobrana w taki nale˝y uwzgl´dniç te zwierz´ta wÊród tych przeznasposób, by wykazaç zale˝noÊç typu dawka-odpoczonych do perfuzji. Je˝eli badanie jest wykonywane wiedê i poziom bez obserwowanego dzia∏ania szkow po∏àczeniu z innym przy powtarzanym dawkowadliwego (NOAEL) wnajni˝szej dawce. Wzasadzie poniu, to nale˝y stosowaç odpowiednie liczby zwierzàt ziomy dawkowania nale˝y dobraç w taki sposób, by tak, by spe∏niç wymagania obydwu metod. Minimalne pierwotne dzia∏anie toksyczne na uk∏ad nerwowy liczby zwierzàt na grup´ w ró˝nych kombinacjach bamo˝na by∏oby odró˝niç od wp∏ywów zwiàzanych daƒ podano wtabeli B.43.1. Je˝eli planuje si´ likwidaz toksycznoÊcià ogólnoustrojowà. Stosowanie dwóch cj´ zwierzàt w trakcie doÊwiadczenia bàdê te˝ dodatdo trzech przedzia∏ów jest optymalne, acz´sto dodatkowe grupy celem obserwacji odwracalnoÊci, trwa∏okowa czwarta grupa jest lepsza ni˝ stosowanie bardzo Êci lub opóênionego wystàpienia skutków toksycznych du˝ych przedzia∏ów (np. wi´kszych ni˝ 10) pomi´dzy po nara˝eniu lub gdy planuje si´ dodatkowe obserwadawkami. Tam gdzie istnieje wiarygodna ocena nacje, to wtedy liczba zwierzàt powinna byç zwi´kszona ra˝enia ludzi, to tak˝e ona powinna byç brana pod tak, by zapewniç zwierz´ta potrzebne do obserwacji uwag´. i badaƒ histopatologicznych. 1.5.5. Badanie przy zastosowaniu dawki granicznej 1.5.2. Grupy nara˝ane i kontrolne Je˝eli badanie w jednej dawce na poziomie przy- Ogólnie stosowaç nale˝y przynajmniej trzy grupy najmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ, przy zastosonara˝ane igrup´ kontrolnà, ale je˝eli na podstawie inwaniu procedury opisanej w niniejszej metodzie, nie nych danych nie przewiduje si´ skutków przy powtarzanym dawkowaniu dawki 100 mg/kg masy cia- daje rezultatu w postaci mo˝liwych do zaobserwo- ∏a/dzieƒ, to mo˝na wykonaç badanie przy zastosowa- wania skutków neurotoksycznych i je˝eli nie nale˝aniu dawki granicznej. Je˝eli brak jest wiarygodnych ∏o si´ spodziewaç skutków na podstawie istniejàcych danych, to mo˝na przeprowadziç badanie wst´pne ce- danych co do strukturalnie podobnych zwiàzków, to lem ustalenia zakresu dawek w badaniu w∏aÊciwym. wtedy pe∏ne badanie z trzema poziomami dawek Zwierz´ta grupy kontrolnej powinny byç traktowane mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne. Spodziewane tak samo pod ka˝dym wzgl´dem jak zwierz´ta nara˝a- nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zastone, z wyjàtkiem podawania badanej substancji. Je˝eli sowania wy˝szej dawki stosowanej doustnie w baprzy podawaniu badanej substancji stosuje si´ noÊnik, daniu dawki granicznej. W przypadku innych sposoto grupa kontrolna powinna otrzymywaç noÊnik bów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê skórne, w najwy˝szej zastosowanej obj´toÊci. w∏asnoÊci fizykochemiczne badanej substancji, takie jak rozpuszczalnoÊç, cz´sto mogà wskazywaç na 1.5.3. Sprawdzenie wiarygodnoÊci maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia. W badaniu ostrym doustnym dawka w badaniu Laboratorium wykonujàce badanie powinno dawki granicznej powinna wynosiç przynajmniej przedstawiç dane wykazujàce jego zdolnoÊç do wy- 2000 mg/kg.

1.5.6. Podawanie dawek 1.6.1.1. Obserwacje ogólnego stanu zdrowia i ÊmiertelnoÊci/zachorowalnoÊci Zwierz´ta sà nara˝ane codziennie, siedem dni w tygodniu, przez przynajmniej 28 dni; zastosowanie Wszystkie zwierz´ta nale˝y dok∏adnie obserwowaç 5-dniowego re˝imu dawkowania lub krótszego czasu pod wzgl´dem stanu ich zdrowia przynajmniej raz nara˝enia musi byç uzasadnione. Gdy substancja po- dziennie, atak˝e przynajmniej dwa razy dziennie pod dawana jest sondà, nale˝y podawaç pojedyncze daw- wzgl´dem ÊmiertelnoÊci i zachorowalnoÊci. ki, stosujàc odpowiednià sond´ ˝o∏àdkowà lub kaniul´ intubacyjnà. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo- 1.6.1.2. Szczegó∏owe obserwacje kliniczne ˝e byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. Obj´toÊç nie powinna przekraczaç Szczegó∏owe obserwacje kliniczne nale˝y prowa- 1ml/100 g masy cia∏a. Jednak˝e w przypadku roztwo- dziç dla wszystkich zwierzàt wybranych do tego celu rów wodnych mo˝na braç pod uwag´ u˝ycie (zobacz tabela B.43.1) raz przed pierwszym nara˝e- 2ml/100gmasy cia∏a. Nale˝y zminimalizowaç zmiany niem (by umo˝liwiç dalsze porównania) i nast´pnie obj´toÊci, dostosowujàc st´˝enia tak, by zapewniç sta- w ró˝nych odst´pach w zale˝noÊci od czasu trwania ∏à obj´toÊç na wszystkich poziomach dawek poza sub- badania (zobacz tabela B.43.2). Szczegó∏owe obserwastancjami dra˝niàcymi i ˝ràcymi, które w wy˝szych cje kliniczne wgrupie satelitarnej nale˝y prowadziç na st´˝eniach mogà zwi´kszyç skutki dzia∏ania. koniec okresu rekonwalescencji. Szczegó∏owe obserwacje kliniczne nale˝y prowadziç poza klatkà w stan- W przypadku substancji podawanych z paszà lub dardowych warunkach. Stosowane kryteria i skale wodà pitnà wa˝ne jest, by zapewniç, ˝e wprowadzenie punktowe powinny byç wyraênie okreÊlone przez laodpowiedniej iloÊci badanej substancji nie zak∏óci boratorium badawcze. Nale˝y do∏o˝yç staraƒ, aby normalnego ˝ywienia lub bilansu wodnego zwierz´- zmiennoÊç warunków doÊwiadczalnych by∏a minimalcia. Gdy badana substancja podawana jest w paszy, na (niezwiàzana uk∏adowo z nara˝eniem) i by obsernale˝y stosowaç sta∏e st´˝enie wpaszy (ppm) lub sta- wacje by∏y dokonywane przez wyszkolony personel ∏e dawki wstosunku do masy cia∏a; nale˝y opisaç sto- nieznajàcy poziomu nara˝enia zwierzàt. sowany sposób. Je˝eli substancja podawana jest sondà, to powinno to nast´powaç o mniej wi´cej sta∏ych Zaleca si´, aby obserwacje by∏y prowadzone porach ka˝dego dnia i byç dostosowywane na sta∏ym w sposób strukturalny o dobrze okreÊlonych krytepoziomie wzgl´dem masy cia∏a. Gdy badanie przy po- riach (wliczajàc definicj´ normalnego „zakresu”), któwtarzanym podawaniu pokarmowym jest stosowane re sà systematycznie stosowane dla ka˝dego zwierz´- jako wst´p do badania d∏ugoterminowego, to w oby- cia w ka˝dym czasie obserwacji. „Normalny zakres” dwu badaniach stosowaç nale˝y takà samà pasz´. powinien byç odpowiednio udokumentowany. Wszel- Wbadaniach ostrych, je˝eli zastosowanie pojedynczej kie zaobserwowane oznaki powinny byç zapisane. dawki jest niemo˝liwe, to nale˝y podawaç substancj´ Kiedy tylko jest to mo˝liwe, notowaç tak˝e nale˝y wielw mniejszych cz´Êciach przez okres czasu nieprzekra- koÊç obserwowanych zmian. Obserwacje kliniczne poczajàcy 24 godzin. winny obejmowaç, ale nie ograniczaç si´ do zmian na skórze, sierÊci, oczach, b∏onach Êluzowych, wyst´po- 1.6. Obserwacje waniu wydzielin i wydalin oraz objawów autonomicznych (∏zawienie, stroszenie sierÊci, rozmiar êrenicy, 1.6.1. Cz´stotliwoÊç obserwacji i badaƒ nietypowy sposób oddychania i/lub oddychania ustami, oznaki nietypowego oddawania moczu i wydala- Wbadaniach zpowtarzanym dawkowaniem okres nia ka∏u, zmiany zabarwienia moczu). obserwacji powinien pokrywaç okres dawkowania. W badaniach ostrych po nara˝eniu nale˝y stosowaç Notowaç nale˝y wszelkie nietypowe reakcje doty- 14-dniowy okres obserwacji. Dla zwierzàt grup sateli- czàce pozycji cia∏a, poziomu aktywnoÊci (np. zwi´kszetarnych, które sà przetrzymywane bez nara˝ania przez nie lub zmniejszenie penetracji standardowego obszaustalony czas po zakoƒczeniu dawkowania, obserwa- ru) i koordynacji ruchów. Zapisywaç nale˝y zmiany cje powinny pokrywaç si´ z tym czasem. w chodzie (np. chód kaczkowaty, niezbornoÊç koƒczyn), postawie (np. zgrabiony grzbiet) i reakcji na Obserwacje nale˝y czyniç zodpowiednià cz´stotli- traktowanie zwierzàt lub inne bodêce otoczenia, atakwoÊcià celem maksymalizacji prawdopodobieƒstwa ˝e pojawienie si´ ruchów tonicznych lub klonicznych, wykrycia jakichkolwiek nieprawid∏owoÊci behawioral- konwulsji lub drgawek, stereotypii (np. nadmierne nych i/lub neurologicznych. Obserwacje najlepiej pro- czyszczenie si´, niezwyk∏e ruchy g∏owy, krà˝enie wadziç o tej samej porze ka˝dego dnia, bioràc pod w kó∏ko) lub dziwaczne zachowanie si´ (np. kàsanie uwag´ szczytowy okres przewidywanych skutków po lub nadmierne lizanie si´, samookaleczanie, chodzedawkowaniu. Cz´stotliwoÊç obserwacji klinicznych nie ty∏em, wydawanie dêwi´ków) lub agresja. i badaƒ czynnoÊciowych jest podana w tabeli B.43.2. Je˝eli dane kinetyczne i inne uzyskane w poprzednich 1.6.1.3. Badania czynnoÊciowe badaniach wskazujà na potrzeb´ zastosowania innych czasów obserwacji, badaƒ lub okresów poobserwacyj- Podobnie do badaƒ klinicznych badania czynnonych, to nale˝y przyjàç alternatywny schemat celem Êciowe nale˝y przeprowadziç raz przed nara˝eniem uzyskania maksimum mo˝liwych obserwacji. Nale˝y icz´sto wdalszej kolejnoÊci na wszystkich zwierz´tach przedstawiç uzasadnienie zmian schematu obserwa- przeznaczonych do tego celu (zobacz tabela B.43.1). cji. Cz´stotliwoÊç badaƒ czynnoÊciowych jest tak˝e zale˝-

na od czasu trwania badania (zobacz tabela B.43.2). wych badania nale˝y tak˝e przeprowadziç po 13 tygo- W uzupe∏nieniu okresów obserwacji ustalonych w ta- dniach. Nie ma potrzeby prowadzenia badaƒ okulibeli B.43.2 obserwacje czynnoÊciowe grup satelitar- stycznych, je˝eli takie wyniki sà ju˝ dost´pne z innych nych powinny byç wykonane mo˝liwie blisko terminu badaƒ opodobnym czasie trwania ipodobnych poziolikwidacji zwierzàt. Do badaƒ czynnoÊciowych zalicza mach dawek. si´ reaktywnoÊç czuciowà na bodêce ró˝nej modalno- Êci, np.: bodêce s∏uchowe, wizualne iproprioceptywne 1.6.4. Hematologia i biochemia kliniczna (zobacz pozycje 5, 6 i 7 piÊmiennictwa), oszacowanie si∏y uÊcisku (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) i osza- Gdy badanie neurotoksycznoÊci jest wykonywane cowanie aktywnoÊci motorycznej (zobacz pozycja 9 pi- ∏àcznie z ogólnoustrojowym badaniem toksycznoÊci Êmiennictwa). AktywnoÊç motoryczna powinna byç o powtarzanym dawkowaniu, to badania hematolomierzona urzàdzeniem automatycznym zdolnym do giczne i biochemia kliniczna powinny byç wykonane wykrywania wzrostu i spadku aktywnoÊci. Je˝eli sto- w odpowiednim czasie zgodnie z odpowiednià metosowany jest inny zdefiniowany system, to powinien dà badania toksycznoÊci ogólnoustrojowej. Pobranie on dawaç wyniki iloÊciowe, ajego czu∏oÊç iwiarygod- próbek powinno byç wykonane wtaki sposób, by zminoÊç powinny byç wykazane. Ka˝de urzàdzenie po- nimalizowaç jakiekolwiek potencjalne skutki neurobewinno byç sprawdzone celem zapewnienia powtarzal- hawioralne. noÊci w czasie i zgodnoÊci pomi´dzy urzàdzeniami. Dalsze szczegó∏y co do post´powania podano w od- 1.6.5. Badania histopatologiczne powiednich pozycjach piÊmiennictwa. Je˝eli brak jest danych (np.: struktura-aktywnoÊç, dane epidemiolo- Badanie neuropatologiczne powinno uzupe∏niaç giczne, inne badania toksykologiczne) wykazujàcych irozszerzaç obserwacje poczynione podczas fazy in vimo˝liwe skutki neurotoksyczne, to nale˝y wziàç pod vobadania. Tkanki zprzynajmniej 5 zwierzàt/p∏eç/gruuwag´ wykonanie bardziej specjalistycznych badaƒ p´ (zobacz tabela B.43.1 i nast´pny akapit) powinny czynnoÊci sensorycznych i motorycznych lub uczenia byç utrwalone in situprzy zastosowaniu ogólnie uznasi´ i zapami´tywania celem zbadania tych skutków nych metody perfuzji i utrwalania (zobacz pozycja 3 bardziej szczegó∏owo. Wi´cej informacji na temat ba- rozdzia∏ 5 piÊmiennictwa i pozycja 4 rozdzia∏ 50 pidaƒ specjalistycznych i ich zastosowania podano Êmiennictwa). Zapisywaç nale˝y wszelkie zmiany maw pozycji 1 piÊmiennictwa. kroskopowe. Gdy badanie jest wykonywane jako samodzielne lub w celu wykrycia neurotoksycznoÊci lub W wyjàtkowych sytuacjach zwierz´ta wykazujàce okreÊlenia skutków neurotoksycznych, pozosta∏e zwieoznaki toksycznoÊci w stopniu znacznie zak∏ócajàcym rz´ta mogà byç u˝yte do badaƒ neurobehawioralnych badania czynnoÊciowe mo˝na wykluczyç z tych ba- (zobacz pozycje 10 i 11 piÊmiennictwa), neuropatolodaƒ. Nale˝y przedstawiç uzasadnienie wykluczenia gicznych (zobacz pozycje 10, 11, 12 i 13 piÊmienniczwierzàt z badaƒ czynnoÊciowych. twa), neurochemicznych (zobacz pozycje 10, 11, 14 i 15 piÊmiennictwa) lub elektrofizjologicznych (zobacz 1.6.2. Masa cia∏a i spo˝ycie paszy/wody pozycje 10, 11, 16 i17 piÊmiennictwa) uzupe∏niajàcych procedury niniejszej metody lub do zwi´kszenia liczby W badaniach, które trwajà do 90 dni, wszystkie zwierzàt do badaƒ histopatologicznych. Te procedury zwierz´ta powinny byç wa˝one przynajmniej raz wty- uzupe∏niajàce majà szczególne znaczenie, gdy obsergodniu, a pomiary spo˝ycia paszy (wody, gdy badana wacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazujà substancja podawana jest w tym noÊniku) w odst´- na specyficzny rodzaj lub sposób dzia∏ania neurotokpach przynajmniej tygodniowych. Wprzypadku badaƒ sycznego (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Pozod∏ugoterminowych wszystkie zwierz´ta powinny byç sta∏e zwierz´ta mo˝na tak˝e odpowiednio u˝yç do bawa˝one przez pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu daƒ patologicznych opisanych w metodach z zastosoi nast´pnie przynajmniej co 4 tygodnie. Pomiary spo- waniem powtarzanego dawkowania. ˝ycia paszy (wody, gdy badana substancja podawana jest w tym noÊniku) powinny byç dokonywane przez Wszystkie próbki tkanek nale˝y wybarwiç ogólnie pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu i nast´pnie stosowanymi technikami barwienia zwykorzystaniem w oko∏o 3-miesi´cznych odst´pach, chyba ˝e stan hematoksyliny i eozyny (H&E), zatopiç w parafinie zdrowia lub zmiany masy cia∏a sugerujà inny sposób izbadaç technikà mikroskopowà. Je˝eli obserwuje si´ post´powania. lub podejrzewa oznaki ogólnej neuropatii obwodowej, to nale˝y badaç próbki tkanki nerwu obwodowego za- 1.6.3. Badania okulistyczne topione w tworzywie sztucznym. Objawy kliniczne mogà tak˝e sugerowaç badania dodatkowych miejsc W badaniach o czasie trwania d∏u˝szym ni˝ 28 dni bàdê te˝ zastosowanie specjalnych technik barwienia. badanie okulistyczne przy pomocy oftalmoskopu lub Wskazówki dotyczàce badania innych miejsc mo˝na innego równorz´dnego urzàdzenia powinno byç wy- znaleêç w pozycjach 3 i 4 piÊmiennictwa. Pomocne konane przed podaniem badanej substancji i na ko- mogà byç odpowiednie barwienia celem wykazania niec badania u wszystkich zwierzàt lub, co najmniej specyficznych rodzajów zmian patologicznych (zobacz u zwierzàt otrzymujàcych najwy˝szà dawk´ i zwierzàt pozycja 18 piÊmiennictwa). z grupy kontrolnej. Je˝eli wykryte zostanà zmiany w oczach lub je˝eli oznaki kliniczne wskazujà na po- Reprezentatywne skrawki centralnego i obwodotrzeb´ badaƒ, to wszystkie zwierz´ta nale˝y poddaç ta- wego uk∏adu nerwowego powinny byç badane histokim badaniom. W przypadku badaƒ d∏ugotermino- logicznie (zobacz pozycja 3 rozdzia∏ 5 piÊmiennictwa

ipozycja 4 rozdzia∏ 50 piÊmiennictwa). Badane powin- nia lub uÊmierconych w humanitarny sposób oraz no byç: przodomózgowie, cz´Êç centralna mózgu, czas ich padni´cia lub uÊmiercenia, liczb´ zwierzàt wyw tym przekrój przez podwzgórze, Êródmó˝d˝e, mó˝- kazujàcych oznaki toksycznoÊci, opis zaobserwowad˝ek, most, rdzeƒ przed∏u˝ony, oko znerwem wzroko- nych oznak toksycznoÊci wraz zczasem ich pojawienia wym i siatkówkà, rdzeƒ kr´gowy z odcinka szyjnego si´, czasem trwania, rodzajem i nasileniem wszelkich i zgrubienia l´dêwiowego, zwój górny nerwu b∏´dne- skutków toksycznych, liczbà zwierzàt wykazujàcych go, grzbietowe i brzuszne w∏ókna nerwu b∏´dnego, zmiany chorobowe wraz z ich rodzajem i nasileniem. proksymalny nerw kulszowy, proksymalny nerw piszczelowy (przy kolanie), nerw piszczelowy mi´Ênia ∏yd- 2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników kowego. Sekcja rdzenia kr´gowego i nerwu obwodowego powinna zawieraç przekroje pod∏u˝ne i po- Dane z badaƒ nale˝y wyceniç pod wzgl´dem wyprzeczne. Szczególnà uwag´ nale˝y zwróciç na una- st´powania, nasilenia i korelacji skutków neurobehaczynienie uk∏adu nerwowego. Zbadaç nale˝y tak˝e wioralnych ineuropatologicznych (neurochemicznych próbk´ mi´Ênia szkieletowego, wszczególnoÊci ∏ydko- lub elektrofizjologicznych skutków tak˝e, je˝eli prowawego. Uwag´ nale˝y tak˝e zwróciç na miejsca ostruk- dzone by∏y badania uzupe∏niajàce) oraz jakichkolwiek turze komórkowej i w∏óknistej w centralnym i obwo- innych obserwowanych skutków. O ile to mo˝liwe, to dowym uk∏adzie nerwowym, o których wiadomo, ˝e dane liczbowe powinny zostaç poddane w∏aÊciwej szczególnie podlegajà wp∏ywom przez substancje i ogólnie uznanej analizie statystycznej. Metody statyneurotoksyczne. styczne nale˝y dobraç na etapie projektowania do- Êwiadczenia. Wskazówki dotyczàce zmian neuropatologicznych typowych po nara˝eniu na substancj´ toksycznà mo˝- 3. SPRAWOZDANIE na znaleêç w pozycjach 3, 4 piÊmiennictwa. Zaleca si´ etapowe badanie próbek tkanek, gdzie wycinki uzy- Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce inskane od zwierzàt z grupy otrzymujàcej substancj´ formacje: wnajwy˝szej dawce sà najpierw porównywane ztymi uzyskanymi od zwierzàt z grupy kontrolnej. Je˝eli nie Badana substancja: obserwuje si´ zmian neuropatologicznych w wycinkach z tych grup, to dalsza analiza nie jest konieczna. — w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryza- Je˝eli w wycinkach uzyskanych od zwierzàt z grupy cja, czystoÊç), otrzymujàcej substancj´ w najwy˝szej dawce obser- — dane identyfikacyjne. wuje si´ zmiany, to próbki tkanek uzyskanych od zwierzàt, które mog∏y podlegaç potencjalnym wp∏ywom NoÊnik (o ile by∏ stosowany): substancji podawanej wdawkach poÊrednich inajni˝- szej, muszà zostaç zakodowane i kolejno przebadane. — uzasadnienie wyboru noÊnika. Je˝eli w badaniach jakoÊciowych zostanà stwier- Zwierz´ta doÊwiadczalne: dzone zmiany neuropatologiczne, to nale˝y przeprowadziç drugie badanie we wszystkich miejscach uk∏a- — stosowany gatunek/szczep, du nerwowego wykazujàcych te zmiany. Skrawki uzy- — liczba, wiek i p∏eç zwierzàt, skane od zwierzàt otrzymujàcych substancje w dawkach na wszystkich badanych poziomach z ka˝dego — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, potencjalnie zmienionego regionu nale˝y zakodowaç pasza itd., i zbadaç losowo bez znajomoÊci kodu. Nale˝y zapisaç — masy zwierzàt (ka˝de zwierz´ oddzielnie) na pocz´stoÊç ka˝dej zmiany i jej nasilenie. Po zbadaniu czàtku doÊwiadczenia. wszystkich regionów ze wszystkich grup otrzymujacych substancje w ró˝nych dawkach kod nale˝y z∏a- Warunki przeprowadzania badania: maç i wykonaç analiz´ statystycznà celem oszacowania zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Nale˝y opisaç przy- — szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substank∏ady ró˝nych stopni nasilenia ka˝dej zmiany. cji/przygotowania paszy, uzyskane st´˝enie, trwa- ∏oÊç i jednorodnoÊç u˝ywanego preparatu, Zmiany neuropatologiczne nale˝y oceniaç w kontekÊcie obserwacji i pomiarów behawioralnych, a tak- — podawane dawki, w tym dane dotyczàce noÊnika, ˝e innych danych z poprzednich i obecnego badania jego obj´toÊci i stanu skupienia, toksycznoÊci substancji. — szczegó∏y podawania badanej substancji, 2. WYNIKI — uzasadnienie wyboru dawek, — uzasadnienie sposobu podawania i czasu trwania 2.1. Opracowanie wyników nara˝enia, Nale˝y przedstawiç wyniki dla poszczególnych — przeliczenie st´˝enia badanej substancji w pazwierzàt. Ponadto wszystkie dane nale˝y zestawiç szy/wodzie (ppm) na rzeczywistà dawk´ (mg/kg w postaci tabelarycznej, wykazujàc dla ka˝dej grupy masy cia∏a/dzieƒ), gdy podawano wpaszy/wodzie, i grupy kontrolnej liczb´ zwierzàt na poczàtku do- Êwiadczenia, liczb´ zwierzàt martwych wtrakcie bada- — szczegó∏y dotyczàce jakoÊci paszy i wody.

Obserwacje i procedury badaƒ: 4. PIÂMIENNICTWO — szczegó∏y dotyczàce przypisania poszczególnych 1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Tezwierzàt w ka˝dej grupie do podgrup przeznaczosting Strategies and Test Methods. OECD, Paris, nych do perfuzji, In Preparation. — szczegó∏y systemu punktacji wraz z kryteriami 2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity iskalà punktowà dla ka˝dego pomiaru wszczegó- Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemi- ∏owych obserwacjach klinicznych, cals. In preparation. — szczegó∏y badaƒ czynnoÊciowych oddzia∏ywania czuciowego na bodêce o ró˝nej modalnoÊci (np.: 3) World Health Organization (WHO) (1986). Environs∏uchowe, wzrokowe, proprioceptywne); szaco- mental Health Criteria document 60: Principles wanie si∏y chwytnoÊci, szacowanie aktywnoÊci ru- and Methods for the Assessment of Neurotoxicity chowej (wraz ze szczegó∏ami zbadaƒ wykrywania associated with Exposure to Chemicals. aktywnoÊci urzàdzeniami automatycznymi) oraz inne stosowane procedury, 4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spen- — szczegó∏y badaƒ okulistycznych i, o ile wykonycer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and wano, badaƒ hematologicznych, biochemii kli- Wilkins, Baltimore/ London. nicznej wraz zwartoÊciami uzyskanymi uzwierzàt z grupy kontrolnej, 5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. — szczegó∏y dotyczàce poszczególnych procedur Exp., 40, 999—1003. neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych. 6) Gad, S.C. (1982). ANeuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. He- Wyniki: alth, 9, 691—704. — masy cia∏a/zmiany masy cia∏a zwierzàt tak˝e tych 7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. po uÊmierceniu, (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using — spo˝ycie paszy i wody, o ile dotyczy, aFunctional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., — dane dotyczàce reakcji toksycznych wed∏ug p∏ci 108, 267—283. i poziomu dawkowania, w tym oznaki toksyczno- Êci lub ÊmiertelnoÊç, 8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). AMethod for the Routine Assessment — charakter, nasilenie i czas trwania (czas pojawieof Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and nia si´ i przebieg) szczegó∏owych obserwacji kli- Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233—236. nicznych (odwracalne czy nie), 9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, — szczegó∏owy opis wszystkich wykonanych badaƒ M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. czynnoÊciowych, (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Acti- — wyniki badania sekcyjnego, vity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, — szczegó∏y wszelkich zmian neurobehawioralnych, 599—609. neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, 10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven — dane o absorpcji i metabolizmie, o ile dost´pne, Press, New York. — analiza statystyczna, gdy stosowano. 11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York. Dyskusja wyników: 12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for — zale˝noÊç dawka-odpowiedê, Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689—695. — zwiàzek jakichkolwiek innych skutków toksycznych z wnioskiem o potencjale neurotoksycznym 13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and badanej substancji, MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic — poziom dawki bez obserwowanego dzia∏ania Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and szkodliwego. Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343—352. Wnioski: 14) O’Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic — okreÊlenie ogólnej neurotoksycznoÊci badanej Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. substancji. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445—452.

15) O’Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute 17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Me- Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Re- thods in neurotoxicity Testing. In: Experimental sults in Persistent Changes in Neurotypic and and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co.,. 368—378. Baltimore/London, pp. 726—742. 16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. 18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and (1982). Electrophysiological Techniques in Neuro- Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, toxicology. In: Nervous System Toxicology. Mit- Neuropathological Techniques. Lowe, James and chell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299—335. Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

:1.34.B alebaT imainadab imynni z ijcanibmok w bul einleizddo ´is ejunokyw icÊonzcyskotoruen einadab ydg,eipurg w tàzreiwz ybzcil enlaminiM.icÊonzcyskotoruen ainadab çÊ´zc okaj hcynzcinilk ijcawresbo hcywo∏ógezczsi hcywoicÊonnyzc ƒadab od hcynozcanzezrp tàzreiwz ç´ip mytW *

Tabela B.43.2: Cz´stotliwoÊç obserwacji klinicznych i badaƒ czynnoÊciowych Za∏àcznik nr 11 C.21. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN AZOTU 1. METODA twa). Uwzgl´dnione zosta∏y równie˝ inne wytyczne, takie jak niemieckie Biologicznego Urz´du Federalne- Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- go (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa), amerykaƒskiej sanej w Wytycznej OECD nr 216 (2000). Agencji Ochrony Ârodowiska US EPA (zobacz pozycja3 piÊmiennictwa), SETAC (zobacz pozycja 4 pi- 1.1. Wst´p Êmiennictwa) oraz Mi´dzynarodowej Organizacji Standaryzacji ISO (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa). Niniejsza metoda opisuje laboratoryjnà metod´ Podczas posiedzenia OECD na temat wyboru glebadawczà s∏u˝àcà do oceny d∏ugoterminowego wp∏y- by/osadu w Belgirate, W∏ochy w 1995 r. (zobacz pozywu substancji chemicznych, po jednorazowym nara- cja 6 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ irodzaj gleby, ˝eniu, na aktywnoÊç mikroorganizmów glebowych które mo˝na zastosowaç w badaniach wykonanych w przemianach azotu. Badanie opiera si´ g∏ównie na wg niniejszej metody. Zalecenia w zakresie pobierazaleceniach Europejskiej i Âródziemnomorskiej Orga- nia, opracowania i przechowywania próbek glebonizacji Ochrony RoÊlin (zobacz pozycja 1 piÊmiennic- wych, opierajà si´ na Dokumencie Przewodnim ISO

(zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa) oraz na ustaleniach byç badane jako substancje aktywne (s.a.) lub w popodj´tych podczas spotkania roboczego w Belgirate. staci gotowych form u˝ytkowych. Jednak˝e niniejsze Podczas okreÊlania i szacowania charakterystyki tok- badanie nie ogranicza si´ tylko do agrochemikaliów. sykologicznej badanych substancji konieczne mo˝e Zmieniajàc zarówno iloÊç badanej substancji stosowaokazaç si´ oznaczenie ich wp∏ywu na aktywnoÊç mi- nej do gleby, jak isposób opracowania danych, badakroorganizmów glebowych, np.: gdy wymagane sà nie mo˝e byç równie˝ wykonane w przypadku subdane dotyczàce potencjalnych skutków ubocznych stancji chemicznych, w stosunku do których nie jest Êrodków ochrony roÊlin na mikroflor´ glebowà lub znana spodziewana ich iloÊç w glebie. Dlatego dla gdy spodziewane jest nara˝enie mikroorganizmów substancji innych ni˝ agrochemikalia oznacza si´ glebowych na substancje chemiczne inne ni˝ Êrodki wp∏yw serii st´˝eƒ na przemiany azotu. Dane z tych ochrony roÊlin. Badanie przemian azotu wykonuje si´ badaƒ u˝ywane sà do wyznaczenia krzywej zale˝noÊci w celu okreÊlenia wp∏ywu takich substancji chemicz- dawka-odpowiedê i wyliczenia wartoÊci EC, gdzie x nych na mikroflor´ glebowà. Podczas badania agro- x jest zdefiniowanym % skutku. chemikaliów (Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, chemikalia stosowane wleÊnictwie) wykonuje si´ zarówno ba- 1.2. Definicje danie przemian azotu, jak i badanie przemian w´gla. Przemiany azotu:to rozk∏ad przez mikroorganizmy Przy badaniach innych substancji wystarczajàce jest materii organicznej zawierajàcej azot poprzez procesy badanie przemian azotu. Je˝eli jednak wartoÊç EC 50 amonifikacji i nitryfikacji do odpowiedniego nieorgaw badaniu przemian azotu dla takich substancji znajnicznego azotanowego produktu koƒcowego. duje si´ w tym samym zakresie jak dla handlowo dost´pnych inhibitorów procesu nitryfikacji (np. nitrapy- EC (St´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej rina), to w celu zebrania dalszych informacji powinno x substancji w glebie powodujàcym x procent inhibicji byç wykonane badanie przemian w´gla. przemian azotu do azotanów. Gleby sk∏adajà si´ z˝ywych inieo˝ywionych sk∏ad- EC (Medialne st´˝enie efektywne): jest st´˝e- 50 ników, które istniejà w z∏o˝onych i heterogenicznych niem badanej substancji wglebie powodujàcym 50 % mieszaninach. Mikroorganizmy odgrywajà wa˝nà rol´ inhibicj´ przemian azotu do azotanów. w rozk∏adzie i przemianach materii organicznej w ˝yznych glebach, zwieloma gatunkami majàcymi wk∏ad 1.3. Substancje kontrolne w ró˝ne aspekty u˝yênienia gleby. D∏ugoterminowe Brak. zak∏ócenie tych procesów biochemicznych mo˝e potencjalnie oddzia∏ywaç na krà˝enie sk∏adników od˝yw- 1.4. Zasada metody badawczej czych i poprzez to zmieniaç ˝yznoÊç gleby. Przemiany azotu i w´gla nast´pujà we wszystkich ˝yznych gle- Do przesianej gleby dodaje si´ sproszkowany subbach. Chocia˝ zespo∏y mikroorganizmów odpowie- strat roÊlinny, a próbk´ poddaje si´ dzia∏aniu badanej dzialne za te procesy ró˝nià si´ mi´dzy glebami, to substancji lub pozostawia bez dodatku badanej subszlaki przemian sà zasadniczo takie same. stancji (badanie kontrolne). Je˝eli badane sà agrochemikalia, to zaleca si´ minimum dwa st´˝enia, które po- Badanie opisane w niniejszej metodzie ma s∏u˝yç winny byç wybrane w odniesieniu do najwy˝szego wykrywaniu d∏ugoterminowych szkodliwych wp∏y- st´˝enia, jakie przewiduje si´ wwarunkach polowych. wów substancji na proces przemiany azotu waerobo- Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleby badanej wych glebach powierzchniowych. Metoda badawcza i kontrolnej sà poddawane ekstrakcji z odpowiednim pozwala tak˝e na oszacowanie wp∏ywów substancji rozpuszczalnikiem i w ekstraktach oznacza si´ iloÊci na przemiany w´gla przez mikroflor´ glebowà. Po- azotanów. IloÊç wytworzonych azotanów w próbkach wstawanie azotanów ma miejsce w nast´pstwie roz- badanych jest porównywana z wartoÊcià w próbkach padu wiàzaƒ w´giel-azot. Dlatego te˝, je˝eli wglebach kontrolnych. Nast´pnie oblicza si´ procent odchylenia kontrolnych i badanych znajduje si´ równe iloÊci wy- w stosunku do gleby kontrolnej. Wszystkie badania twarzanych azotanów, to wysoce prawdopodobny jest prowadzone sà przez przynajmniej 28 dni. Je˝eli fakt, ˝e g∏ówne szlaki przemian w´gla sà nienaruszone 28dnia ró˝nica mi´dzy próbkami kontrolnymi i badai funkcjonalne. Substrat wybrany do badania (sprosznymi jest równa lub wi´ksza ni˝ 25 %, to pomiary konkowana lucerna) ma korzystny stosunek w´gla do azotynuowane sà maksymalnie 100 dni. Je˝eli badane sà tu (zazwyczaj pomi´dzy 12:1 i 16:1). Z tego powodu substancje inne ni˝ agrochemikalia, to do próbek glezredukowany jest niedobór w´gla w czasie badania by dodaje si´ badanà substancj´ w st´˝eniach stanoi je˝eli zespo∏y mikroorganizmów sà zniszczone przez wiàcych seri´, a iloÊci azotanów w próbce kontrolnej substancj´ chemicznà, to mogà si´ one odrodziç ipróbkach badanych oznacza si´ po 28 dniach inkubaw ciàgu 100 dni. cji. Wyniki badaƒ z wieloma st´˝eniami analizowane sà przy pomocy modelu regresji. Wyliczane sà warto- Badanie, z którego wywodzi si´ niniejsza metoda Êci ECx (np.: EC, EC i/lub EC). badawcza, by∏o pierwotnie zaprojektowane dla sub- 50 25 10 stancji, których iloÊç wglebie mo˝na by∏o przewidzieç. 1.5. WiarygodnoÊç badania Tak jest na przyk∏ad wprzypadku Êrodków ochrony ro- Êlin, dla których znana jest ich iloÊç stosowana w po- Szacowanie wyników badania dla agrochemikalu. W przypadku agrochemikaliów wystarczajàce jest liów opiera si´ na stosunkowo ma∏ych ró˝nicach (tj. badanie dwóch dawek, jakie przewiduje si´ lub przy- Êrednia wartoÊç (25 %) pomi´dzy st´˝eniami azotapuszcza, ˝e b´dà stosowane. Agrochemikalia mogà nów w próbkach kontrolnych i próbkach badanych,

wi´c du˝e odchylenia w grupie kontrolnej mogà pro- 1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby wadziç do fa∏szywych wyników. Dlatego zmiennoÊç pomi´dzy powtórzeniami w grupie kontroli powinna 1.6.3.1. Pobieranie próbek gleby wynosiç mniej ni˝ ±15 %. Dost´pne powinny byç szczegó∏owe informacje 1.6. Opis metody badawczej dotyczàce historii miejsca, z którego pobierana jest gleba do badaƒ. Podaç nale˝y dok∏adne miejsce, ro- 1.6.1. Wyposa˝enie dzaj roÊlinnoÊci pokrywajàcej, daty zastosowania Êrodków ochrony roÊlin, zastosowanie nawozów or- Wbadaniu stosuje sà naczynia wykonane zoboj´t- ganicznych i nieorganicznych, dodatki materia∏ów nego chemicznie materia∏u. Powinny byç one odpo- biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. wiedniej wielkoÊci w zale˝noÊci od zastosowanej pro- Miejsce, z którego pobiera si´ próby gleby do badaƒ, cedury inkubacji gleb, tj. inkubacji ca∏ej partii gleby powinno byç tak dobrane, aby umo˝liwiç d∏ugotermilub jako seria poszczególnych próbek glebowych (zo- nowe jego u˝ycie. Odpowiednie sà pastwiska stale bacz pkt 1.7.1.2). Nale˝y poczyniç starania, by zmini- wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami malizowaç straty wody z jednej strony, a z drugiej by zbó˝ (z wyjàtkiem kukurydzy) lub g´sto zasiane zieloumo˝liwiç wymian´ gazowà podczas badania (np.: na- ne ∏àki. Miejsce wybrane do pobierania próbek nie poczynia stosowane wbadaniu mogà byç przykryte per- winno byç poddawane zabiegom z u˝yciem Êrodków forowanà folià polietylenowà). Gdy badane sà sub- ochrony roÊlin przez minimum jeden rok przed pobrastancje lotne, powinny byç stosowane szczelne i nie- niem próbek. Ponadto przez przynajmniej szeÊç mieprzepuszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieç si´cy przed pobieraniem prób nie powinno stosowaç takie rozmiary, aby próbka gleby wype∏nia∏a wprzybli- si´ ˝adnego nawozu organicznego. Zastosowanie na- ˝eniu jednà czwartà ich obj´toÊci. wozu mineralnego jest mo˝liwe tylko w przypadku wymagania tego przez roÊliny uprawne, a próbki gle- Stosowane jest standardowe wyposa˝enie labora- by nie powinny byç pobierane wczeÊniej ni˝ trzy mietoryjne: siàce po zastosowaniu nawozu. Nale˝y unikaç wykorzystywania gleb, na których stosowano nawozy — urzàdzenie wytrzàsajàce: wytrzàsarka mechaniczoznanych skutkach dzia∏ania biobójczego (np. cyjanana lub inne odpowiednie, mid wapnia). — wirówka (3000 g) lub urzàdzenie do filtracji (z wy- Nale˝y unikaç pobierania próbek podczas lub tu˝ korzystaniem filtrów papierowych wolnych od po d∏ugich okresach suszy (d∏u˝sze ni˝ 30 dni) lub azotanów), sp∏ywów wody. Wprzypadku gleb ornych próbki nale- ˝y pobieraç zg∏´bokoÊci 0 do 20 cm. Wprzypadku ∏àk — urzàdzenie o odpowiedniej czu∏oÊci i powtarzal- (pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie by∏a przenoÊci do analizy azotanów. prowadzana przez d∏ugie okresy (przynajmniej jeden sezon), maksymalna g∏´bokoÊç pobierania próbek 1.6.2. Wybór i liczba gleb mo˝e wynosiç nieco wi´cej ni˝ 20 cm (np. do 25 cm). Próbki gleby powinny byç transportowane wpojemni- Powinno stosowaç si´ gleb´ jednego rodzaju. Zakach i temperaturze, które gwarantujà, ˝e pierwotne leca si´ stosowaç gleb´ o nast´pujàcej charakterystyw∏aÊciwoÊci gleby nie zostanà znaczàco zmienione. ce: — zawartoÊç piasku: nie mniej ni˝ 50 % i nie wi´cej 1.6.3.2. Przechowywanie próbek gleby ni˝ 75 %, Najbardziej w∏aÊciwe jest stosowanie gleby Êwie- — wartoÊç pH: 5,5—7,5, ˝o pobranej z pola. Je˝eli jednak nie ma sposobu na unikni´cie przechowywania w laboratorium, to gleby — zawartoÊç w´gla organicznego: 0,5—1,5 %, mogà byç przechowywane wciemnoÊci wtemperaturze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiàce. Podczas — biomasa mikroorganizmów powinna byç oznaprzechowywania gleby nale˝y zapewniç warunki tleczona (zobacz pozycje 8 i 9 piÊmiennictwa), a zanowe. Je˝eli gleby pobiera si´ z miejsc, gdzie sà one wartoÊç w´gla powinna stanowiç przynajmniej zamarzni´te przez przynajmniej trzy miesiàce w roku, 1% ca∏kowitego w´gla organicznego gleby. to mo˝na rozwa˝yç ich przechowywanie przez szeÊç miesi´cy wtemperaturze od –18 °Cdo –22 °C. Bioma- Najcz´Êciej gleba o takiej charakterystyce jest najs´ mikroorganizmów w przechowywanych glebach bardziej niekorzystnym przypadkiem, poniewa˝ ad- oznacza si´ przed ka˝dym doÊwiadczeniem. W´giel sorpcja badanej substancji jest minimalna, a jej do- w biomasie powinien stanowiç przynajmniej 1 % ca∏- st´pnoÊç dla mikroflory maksymalna. Dlatego te˝ ba- kowitego w´gla organicznego (zobacz pkt 1.6.2). dania z innymi glebami sà w zasadzie niepotrzebne. Jednak˝e wpewnych okolicznoÊciach, np. gdy przewi- 1.6.4. Obróbka iprzygotowanie gleby przed badaniem dywane zastosowanie badanej substancji b´dzie mia- ∏o miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaÊne 1.6.4.1. Inkubacja wst´pna gleby leÊne, lub w przypadku substancji chemicznych na∏adowanych elektrostatycznie, konieczne mo˝e si´ Je˝eli gleba by∏a przechowywana (zobacz okazaç zastosowanie dodatkowej gleby. pkt1.6.3.2), zaleca si´ inkubacj´ wst´pnà przez odpo-

wiedni okres wynoszàcy od 2 do 28 dni. Temperatura kilkakrotnie w czasie sezonu, badane st´˝enia wyznaiwilgotnoÊç gleby podczas inkubacji wst´pnej powin- cza si´, mno˝àc PEC przez maksymalnà przewidywanà ny byç podobne do tych stosowanych w badaniu (zo- liczb´ stosowaƒ. Jednak˝e najwy˝sze stosowane st´- bacz pkt 1.6.4.2. i pkt 1.7.1.3). ˝enie nie powinno przekraczaç dziesi´ciokrotnoÊci maksymalnej jednorazowo zastosowanej dawki. Je˝eli 1.6.4.2. Parametry fizykochemiczne badane sà substancje inne ni˝ agrochemikalia, nale˝y stosowaç seri´ pi´ciu st´˝eƒ w post´pie geometrycz- Gleb´ oczyszcza si´ r´cznie z du˝ych zanieczysz- nym. Badane st´˝enia powinny obejmowaç zakres koczeƒ (np. kamieni, cz´Êci roÊlin) inast´pnie przesiewa nieczny do wyznaczenia wartoÊci EC. x do czàstek o rozmiarach równych lub mniejszych ni˝ 2 mm. WilgotnoÊç gleby powinna byç dostosowana 1.7. Wykonanie badania za pomocà wody destylowanej lub dejonizowanej do wartoÊci pomi´dzy 40 i 60 % maksymalnej pojemno- 1.7.1. Warunki nara˝enia Êci wodnej. 1.7.1.1. St´˝enia substancji badanej i kontrola 1.6.4.3. Dodanie substratu organicznego Je˝eli badane sà agrochemikalia, badanà próbk´ Do gleby nale˝y dodaç odpowiedni substrat orga- gleby dzieli si´ na trzy cz´Êci o równej masie. Dwie niczny, np. sproszkowanà lucern´ (g∏ówny sk∏adnik: cz´Êci miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badany Medicago sativa), wktórym stosunek C:Nzawarty jest produkt, atrzecià cz´Êç miesza si´ znoÊnikiem bez bapomi´dzy 12:1 a16:1. Zaleca si´ stosowaç 5 glucerny danego produktu (kontrola). Zaleca si´ stosowanie mina kilogram gleby (sucha masa). nimum trzech powtórzeƒ dla st´˝eƒ ikontroli. Wprzypadku badania substancji innych ni˝ agrochemikalia 1.6.5. Przygotowanie badanej substancji w celu dodagleb´ dzieli si´ na szeÊç cz´Êci o równej masie. Pi´ç nia do gleby z nich miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badanà substancj´, aszóstà miesza si´ znoÊnikiem bez bada- Badanà substancj´ podaje si´ z noÊnikiem. NoÊninej substancji. Zarówno dla kontroli, jak i badanych kiem mo˝e byç woda (dla substancji rozpuszczalnych serii st´˝eƒ zaleca si´ prowadzenie trzech powtórzeƒ. wwodzie) lub oboj´tna sta∏a substancja, taka jak drob- Nale˝y podjàç wszelkie starania w celu zapewnienia ny piasek kwarcowy (rozmiar czàstek: 0,1—0,5mm). jednorodnego rozprowadzenia badanej substancji Nale˝y unikaç stosowania p∏ynnych noÊników innych w próbkach gleby. Podczas mieszania nale˝y unikaç ni˝ woda (np.: rozpuszczalniki organiczne, takie jak ubijania i zgniatania gleby. aceton, chloroform), poniewa˝ mogà one zniszczyç mikroflor´. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ piasek, to 1.7.1.2. Inkubacja próbek glebowych mo˝e on zawieraç badanà substancj´ rozpuszczonà lub zawieszonà w odpowiednim rozpuszczalniku. Inkubacja próbek glebowych mo˝e byç przeprowa- W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien byç dzona na dwa sposoby: ca∏ej partii gleby zbadanà subusuni´ty przez odparowanie przed wymieszaniem stancjà i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem rówz glebà. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej nych cz´Êci poszczególnych próbek gleby kontrolnej substancji w glebie zaleca si´ stosowanie 10 g piasku i z badanà substancjà. Je˝eli inkubuje si´ ca∏e partie na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrolgleby, to nale˝y przygotowaç du˝à iloÊç próbek kontronych dodaje si´ takà samà iloÊç wody i/lub piasku. lnych izbadanà substancjà, ˝eby podczas badania pobieraç z nich ma∏e próbki do analizy. WyjÊciowa masa Badajàc substancje lotne nale˝y, na tyle na ile to przygotowanej gleby pierwotnej i w st´˝eniach zale˝y mo˝liwe, unikaç strat podczas ich wprowadzania, atakod rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby za- ˝e nale˝y poczyniç starania, by w sposób jednorodny stosowanych powtórzeƒ w analizie oraz przewidywarozprowadziç substancj´ w glebie (np. substancja ponej maksymalnej krotnoÊci pobierania. Gleby inkubowinna zostaç podana do gleby wkilku miejscach). wane w ca∏oÊci przed pobieraniem próbek do analizy 1.6.6. St´˝enia substancji badanej powinny zostaç dobrze wymieszane. Je˝eli gleby sà inkubowane jako poszczególne próbki, to ka˝da z nich, Je˝eli badane sà agrochemikalia, to powinny byç zarówno kontrolna, jak i z badanà substancjà dzielona zastosowane przynajmniej dwa st´˝enia. Ni˝sze st´˝e- jest na wymaganà liczb´ mniejszych próbek ite sà wynie powinno odpowiadaç przynajmniej maksymalnej korzystywane wed∏ug potrzeby. W doÊwiadczeniach, iloÊci substancji, jakiej mo˝na si´ spodziewaç wglebie gdzie przewiduje si´ wi´cej ni˝ dwa pobrania próbek wwarunkach praktycznych, natomiast wy˝sze st´˝enie do analizy, mniejsze próbki powinny byç przygotowapowinno byç wielokrotnoÊcià st´˝enia ni˝szego. St´˝e- ne w iloÊci wystarczajàcej dla wszystkich powtórzeƒ nia badanej substancji dodanej do gleby oblicza si´ we wszystkich punktach czasowych pobierania próprzy za∏o˝eniu jednorodnego rozmieszczenia do g∏´bo- bek. Powinny byç inkubowane przynajmniej trzy pokoÊci 5 cm ig´stoÊci gleby 1,5. Wprzypadku agroche- wtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zomikaliów stosowanych bezpoÊrednio do gleby lub dla bacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badaƒ stosowane substancji chemicznych, których iloÊç w glebie mo˝na powinny byç odpowiednie pojemniki o powierzchni przewidzieç, zalecane st´˝enia badane to maksymalne pozwalajàcej na unikni´cie rozwoju warunków beztle- Przewidywane St´˝enie wÂrodowisku (PEC) ijego pi´- nowych. Je˝eli badane sà substancje lotne, badania ciokrotnoÊç. W przypadku substancji, które stosuje si´ nale˝y prowadziç zserià poszczególnych próbek.

1.7.1.3. Warunki i czas trwania badania 2. WYNIKI Badanie jest wykonywane w ciemnoÊci w tempe- 2.1. Obliczanie wyników raturze pokojowej 20±2 °C. WilgotnoÊç próbek gleby Je˝eli badanie wykonuje si´ zagrochemikaliami, to powinna byç utrzymywana w czasie badania pomi´- iloÊç wytworzonych azotanów w ka˝dej podwójnej dzy 40 % a60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej glepróbce powinna byç zapisana, a Êrednie wartoÊci ze by (zobacz pkt 1.6.4.2) z odchyleniem ±5 %. W miar´ wszystkich powtórzeƒ powinny zostaç zestawione potrzeby mo˝na dodaç wod´ destylowanà lub dejoniwformie tabeli. Przemiany azotu powinny zostaç oszazowanà. cowane za pomocà odpowiedniej i ogólnie uznanej metody statystycznej (np. test F, poziom istotnoÊci5 %). Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni. IloÊci wytworzonego azotanu wyra˝a si´ w mg azota- Je˝eli badane sà agrochemikalia, to porównywane sà nu/kg suchej masy gleby/dzieƒ. IloÊç wytworzonego iloÊci wytworzonych azotanów w próbkach kontrolazotanu w ka˝dym st´˝eniu porównuje si´ z iloÊcià nych izbadanà substancjà. Je˝eli po 28 dniach ró˝nià wglebie kontrolnej iobliczany jest procent odchylenia si´ one owi´cej ni˝ 25 %, to badanie jest kontynuowawzgl´dem kontroli. ne a˝ osiàgnie si´ ró˝nic´ równà lub mniejszà ni˝ 25 % lub przez maksimum 100 dni wzale˝noÊci od tego, co Je˝eli badanie wykonywane jest dla substancji innastàpi wczeÊniej. Dla substancji innych ni˝ agroche- nych ni˝ agrochemikalia, to okreÊla si´ iloÊç wytwomikalia badanie koƒczy si´ po 28 dniach. Po 28 dniach rzonych azotanów w ka˝dym powtórzeniu i dla oszaw próbkach kontrolnych i próbkach gleby z badanà cowania wartoÊci EC wyznacza si´ krzywà zale˝noÊci x substancjà oznacza si´ iloÊç azotanów ioblicza warto- dawka-odpowiedê. IloÊci azotanów (tj. mg azotanu/kg Êci ECx. suchej masy gleby) oznaczonych w próbkach traktowanych po 28 dniach porównuje si´ z próbkami kon- 1.7.2. Pobieranie próbek i analiza gleb trolnymi. Z tych danych oblicza si´ procent inhibicji dla ka˝dego st´˝enia. WartoÊci wyra˝one w procen- 1.7.2.1. Terminy pobierania próbek gleby tach nale˝y korelowaç z odpowiednimi st´˝eniami. Procedury statystyczne powinny umo˝liwiç obliczenie Je˝eli bada si´ agrochemikalia, to próbki gleby do wartoÊci EC. Przy zastosowaniu standardowych prox analizy azotanów pobiera si´ w 0, 7, 14 i 28 dniu. Je- cedur (zobacz pozycje 10, 11 i 12 piÊmiennictwa) dla ˝eli konieczne jest przed∏u˝enie badania, dalsze po- obliczonych wartoÊci EC x wyznacza si´ tak˝e przedzia- ∏y ufnoÊci (p=0,95). miary powinno wykonywaç si´ w odst´pach 14-dniowych. Badane substancje, które zawierajà du˝e iloÊci azotu, mogà spowodowaç wzrost iloÊci azotanów wy- Je˝eli bada si´ substancje inne ni˝ agrochemikalia, twarzanych w czasie badania. Je˝eli takie substancje to nale˝y stosowaç przynajmniej pi´ç st´˝eƒ, a próbki badane sà wwysokich st´˝eniach (np. substancje stogleby badaç na zawartoÊç azotanów na poczàtku sowane wielokrotnie), to w badaniu musi zostaç za- (dzieƒ 0) i na koniec okresu nara˝enia (28 dzieƒ). Dostosowana w∏aÊciwa kontrola (tj. gleba plus badana datkowy pomiar, np. w 7 dniu, mo˝e byç równie˝ wysubstancja, ale bez substratu roÊlinnego). Dane z takonany, je˝eli zostanie to uznane za konieczne. Dane kiej kontroli nale˝y uwzgl´dniç w obliczeniach wartootrzymane w 28 dniu sà u˝ywane do wyznaczenia Êci EC. x wartoÊci EC dla substancji chemicznej. Je˝eli jest to x wymagane, to dane zpróbek kontrolnych zdnia 0 mo- 2.2. Interpretacja wyników gà zostaç wykorzystane do podania poczàtkowej iloÊci azotanów w glebie. Je˝eli szacuje si´ wyniki z badania agrochemikaliów, a ró˝nica w iloÊci wytworzonych azotanów po- 1.7.2.2. Analiza próbek glebowych mi´dzy ni˝szà dawkà (tj. maksymalnym przewidywanym st´˝eniem w Êrodowisku) a dawkà stosowanà IloÊç wytworzonych azotanów w ka˝dym powtó- w badaniu kontrolnym jest równa lub ni˝sza ni˝ 25 % rzeniu próbek z badanà substancja i glebie kontrolnej wjakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to oznacza si´ za ka˝dym razem podczas pobierania pró- produkt mo˝e zostaç scharakteryzowany jako niemajàcy d∏ugoterminowego wp∏ywu na przemiany azotu bek. Azotany ekstrahuje si´ z gleby przez wytrzàsanie w glebie. Przy szacowaniu wyników z badaƒ substanz odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. 0,1 M roztwocji innych ni˝ agrochemikalia stosuje si´ wartoÊci rem chlorku potasu. Zaleca si´ stosowanie 5 ml roz- EC, EC i/lub EC. tworu KCl na gram suchej masy gleby. W celu opty- 50 25 10 malizacji ekstrakcji naczynia zawierajàce gleb´ do eks- 3. SPRAWOZDANIE trakcji iroztwór ekstrakcyjny powinny byç nape∏nione nie wi´cej ni˝ do po∏owy. Mieszaniny wytrzàsa si´ Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´- przez 60 minut, przy pr´dkoÊci 150 obrotów na minupujàce informacje: t´. Mieszaniny odwirowywuje si´ lub filtruje. Fazy ciek∏e analizuje si´ na zawartoÊç azotanów. Ekstrakty Dok∏adna identyfikacja stosowanej gleby: wolne od czàsteczek mogà byç przechowywane przed analizà wtemperaturze minus 20±5 °Cdo szeÊciu mie- — umiejscowienie geograficzne (d∏ugoÊç, szerosi´cy. koÊç),

— informacje ohistorii miejsca (tj. rodzaj roÊlinnoÊci — liczba powtórzeƒ, pokrywajàcej, zastosowane Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia), — informacja o tym, ile razy pobierano próbki, — metoda stosowana do ekstrakcji azotanów z gle- — zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leÊna, itp.), by. — g∏´bokoÊç pobierania gleby (cm), Wyniki: — zawartoÊç piasku/i∏u/gliny (% suchej masy), — procedura analityczna i sprz´t stosowany do ana- — wartoÊç pH (w wodzie), lizy azotanów, — zawartoÊç w´gla organicznego (% suchej masy), — dane zawierajàce poszczególne wyniki i wartoÊci Êrednie pomiarów azotanów w postaci tabeli, — zawartoÊç azotu (% suchej masy), — odchylenia pomi´dzy powtórzeniami w próbkach — poczàtkowe st´˝enie azotanów (mg azotanów/kg nara˝anych i kontrolnych, suchej masy), — wyjaÊnienia poprawek w obliczeniach, je˝eli ko- — zdolnoÊç wymiany jonowej (mmol/kg), nieczne, — biomasa mikroorganizmów wyra˝ona w procen- — odchylenia w wytwarzaniu azotanów w ka˝dym tach ca∏kowitej zawartoÊci w´gla organicznego, czasie pobierania próbek wyra˝one w procentach lub w postaci wartoÊci EC z 95 % przedzia∏ami — metody stosowane do oznaczenia ka˝dego para- 50 ufnoÊci, inne wartoÊci EC (tj. EC lub EC) metru, x 25 10 z przedzia∏ami ufnoÊci oraz wykres krzywej zale˝- — wszystkie informacje dotyczàce pobierania i prze- noÊci dawka-odpowiedê, chowywania próbek, — statystyczne opracowanie wyników, — szczegó∏y dotyczàce wst´pnej inkubacji gleby. — wszystkie informacje iobserwacje pomocne winterpretacji wyników. Badana substancja: — postaç fizyczna i istotne w∏aÊciwoÊci fizykoche- 4. PIÂMIENNICTWO miczne, 1) EPPO (1994). Decision — Making Scheme for the — nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystoÊç Environmental Risk Assessment of Plant Protec- (tj. dla Êrodków ochrony roÊlin procentowa zawar- tion Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO toÊç substancji aktywnej), zawartoÊç azotu. Bulletin 24: 1—16, 1994. 2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Mi- Substrat: croflora. BBA Guidelines for the Official Testing of — êród∏o substratu, Plant Protection Products, VI, 1—1 (2ndeds., 1990). — sk∏ad (tj. lucerna, lucerna — trawa), 3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances — zawartoÊç w´gla i azotu (% suchej masy), Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. September 28, 1987. — rozmiar sita (mm). 4) SETAC — Europe (1995). Procedures for assessing Warunki badania: the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC — Europe, Brus- — szczegó∏y dotyczàce wzbogacenia gleby substrasels. tem organicznym, 5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determina- — liczba st´˝eƒ badanej substancji i uzasadnienie tion of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in wyboru st´˝eƒ, Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: So- — szczegó∏y dotyczàce sposobu podania badanej il Quality — Biological Methods. PN-ISO substancji do gleby, 14238:2000 JakoÊç gleby — Metody biologiczne — — temperatura inkubacji, Oznaczanie mineralizacji azotu i nitryfikacji w glebach oraz wp∏ywu zwiàzków chemicznych na te — wilgotnoÊç gleby na poczàtku i podczas trwania procesy. badania, 6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop — zastosowana metoda inkubacji gleby (ca∏a partia on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, gleby czy jako seria poszczególnych próbek gleby), 18—20 January 1995.

7) ISO 10381—6 (1993). Soil quality — Sampling. Gu- 9) ISO 14240—2 (1997). Soil quality — Determination idance on the collection, handling and storage of of microbial biomass — Part 2: Fumigation — soil for the assessment of aerobic microbial pro- extraction method. PN-ISO 14240—2:2001 JakoÊç cesses in the laboratory. PN-ISO 10381—6:1998 gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorgani- JakoÊç gleby — Pobieranie próbek — Zasady do- zmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji. tyczàce pobierania, post´powania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych 10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). Asimplified do badania tlenowych (aerobowych) procesów method of evaluating dose — effect experiments. mikrobiologicznych wwarunkach laboratoryjnych. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99—113. 8) ISO 14240—1 (1997). Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 1: Substrate — 11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Caminduced respiration method. PN-ISO 14240— bridge, London and New-York. 1:2001 JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów wglebie — Metoda indukcji od- 12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biologidychania przez dodanie substratu. cal Assay. Griffin, Weycombe, UK. Za∏àcznik nr 12 C.22. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN W¢GLA 1. METODA si´, aby okreÊliç wp∏ywy takich substancji chemicznych na mikroflor´ glebowà. Podczas badania agro- Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- chemikaliów (Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, chemikasanej w Wytycznej OECD nr 217 (2000). lia stosowane wleÊnictwie) wykonuje si´ zarówno badanie przemian w´gla, jak i badanie przemian azotu. 1.1. Wst´p Przy badaniach innych substancji wystarczajàce jest badanie przemian azotu. Je˝eli jednak wartoÊç EC 50 Niniejsza metoda badawcza opisuje laboratoryjnà w badaniu przemian azotu dla takich substancji przyjmetodyk´ s∏u˝àcà do badania d∏ugoterminowych muje wartoÊç zawartà w tym samym zakresie jak dla wp∏ywów Êrodków ochrony roÊlin i innych substancji handlowo dost´pnych inhibitorów nitryfikacji (np. nichemicznych, po jednorazowym nara˝eniu, na aktyw- trapyrina), to badanie przemian w´gla mo˝e byç wynoÊç mikroorganizmów glebowych w przemianach konane celem zebrania dalszych informacji. w´gla. Badanie opiera si´ g∏ównie na zaleceniach Europejskiej i Âródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Gleby sk∏adajà si´ z ˝ywych i nieo˝ywionych RoÊlin (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Brano rów- sk∏adników, które istniejà w z∏o˝onych i heterogenicznie˝ pod uwag´ inne wytyczne, takie jak niemieckiego nych mieszaninach. Mikroorganizmy wraz z wieloma Biologicznego Urz´du Federalnego (zobacz pozycja 2 gatunkami majàcymi wk∏ad w ró˝ne aspekty u˝yêniepiÊmiennictwa), amerykaƒskiej Agencji Ochrony Âro- nia gleby odgrywajà wa˝nà rol´ w rozk∏adzie i przedowiska US EPA (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) mianach materii organicznej w ˝yznych glebach. D∏uoraz SETAC (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa). Pod- goterminowe zak∏ócenie tych procesów biochemiczczas posiedzenia OECD na temat wyboru gleby/osadu nych mo˝e potencjalnie oddzia∏ywaç na krà˝enie w Belgirate, W∏ochy w 1995 r. (zobacz pozycja 5 pi- sk∏adników od˝ywczych ipoprzez to zmieniaç ˝yznoÊç Êmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaj gleby, które gleby. Przemiany w´gla i azotu nast´pujà we wszystmo˝na zastosowaç w badaniach wykonanych wg ni- kich ˝yznych glebach. Chocia˝ zespo∏y mikroorganiniejszej metody. Zalecenia co do pobierania, obróbki zmów odpowiedzialne za te procesy ró˝nià si´ mi´dzy i przechowywania próbek glebowych opierajà si´ na glebami, to szlaki przemian sà zasadniczo takie same. Dokumencie Przewodnim ISO (zobacz pozycja 6 pi- Êmiennictwa) oraz na ustaleniach podj´tych podczas Badanie opisane w niniejszej metodzie ma s∏u˝yç spotkania roboczego w Belgirate. wykrywaniu d∏ugoterminowych szkodliwych wp∏ywów substancji na proces przemiany w´gla waerobo- Podczas okreÊlania i oceny charakterystyki toksy- wych glebach powierzchniowych. Niniejsze badanie kologicznej badanych substancji konieczne mo˝e oka- jest wra˝liwe na wszelkie zmiany wielkoÊci i aktywnozaç si´ oznaczenie ich wp∏ywów na aktywnoÊç mikro- Êci zespo∏ów mikroorganizmów odpowiedzialnych za organizmów glebowych, np. gdy wymagane sà dane przemiany w´gla, poniewa˝ poddaje te zespo∏y zadotyczàce potencjalnych skutków ubocznych dzia∏ania równo stresowi chemicznemu, jak i pozbawia je w´- Êrodków ochrony roÊlin na mikroflor´ glebowà lub gla. Stosowana jest gleba piaszczysta o niskiej zawargdy spodziewane jest nara˝enie mikroorganizmów toÊci materii organicznej. Do tej gleby dodaje si´ baglebowych na substancje chemiczne inne ni˝ Êrodki danà substancj´ i inkubuje w warunkach, które poochrony roÊlin. Badanie przemian w´gla wykonuje zwalajà na szybki metabolizm mikroorganizmów.

W takich warunkach êród∏a ∏atwo dost´pnego w´gla cjà badanà ipróbki gleby kontrolnej sà mieszane zgluw glebie szybko si´ wyczerpujà. Powoduje to niedo- kozà ipo kolejnych 12 godzinach oznacza si´ oddychabór w´gla, co zarówno zabija komórki mikroorgani- nie indukowane glukozà. Oddychanie jest wyra˝one jazmów, jak i indukuje diapauz´ i/lub sporulacj´. Je˝eli ko iloÊç uwolnionego dwutlenku w´gla (mg dwutlenku badanie trwa d∏u˝ej ni˝ 28 dni, to suma tych reakcji w´gla/kg suchej masy gleby/godzin´) lub iloÊç zu˝ytemo˝e byç oznaczona w badaniu kontrolnym (gleby go tlenu (mg tlenu/kg gleby/godzin´). Oddychanie nietraktowane) jako post´pujàca utrata metabolicznie w próbkach z substancjà badanà jest porównywane aktywnej biomasy mikroorganizmów (zobacz pozycja z wartoÊcià kontrolnà i oblicza si´ procent odchylenia 7 piÊmiennictwa). Je˝eli na biomas´ wglebie obcià˝o- wzgl´dem kontroli. Wszystkie badania prowadzone sà nej w´glem, w warunkach badania, ma wp∏yw obec- przynajmniej przez 28 dni. Je˝eli w28 dniu ró˝nica mi´- noÊç substancji chemicznej, to mo˝e ona nie powróciç dzy próbkami kontrolnymi i próbkami z substancjà bado tego samego poziomu co w badaniu kontrolnym. danà jest równa lub wi´ksza ni˝ 25 %, to pomiary sà Dlatego zak∏ócenia spowodowane przez badanà sub- kontynuowane w odst´pach 14-dniowych do maksystancj´ w jakimkolwiek momencie podczas badania malnie 100 dni. Je˝eli badane sà substancje inne ni˝ cz´sto b´dà trwa∏y a˝ do jego zakoƒczenia. agrochemikalia, to do próbek gleby dodaje si´ substancj´ w st´˝eniach stanowiàcych seri´, a oddychanie in- Badanie, z którego wywodzi si´ niniejsza metoda dukowane glukozà (tj. Êrednie iloÊci wytworzonego badawcza, by∏o pierwotnie zaprojektowane dla sub- dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu) oznacza si´ po stancji, których iloÊç wglebie mo˝na by∏o przewidzieç. 28 dniach inkubacji. Wyniki badaƒ z wieloma st´˝enia- Tak jest na przyk∏ad wprzypadku Êrodków ochrony ro- mi analizowane sà przy pomocy modelu regresji. Wyli- Êlin, dla których znana jest ich iloÊç stosowana wpolu. czane sà wartoÊci EC (np.: EC, EC i/lub EC). x 50 25 10 W przypadku agrochemikaliów wystarczajàce jest badanie dwóch dawek, jakie przewiduje si´ lub przypusz- 1.5. WiarygodnoÊç badania cza, ˝e b´dà stosowane. Agrochemikalia mogà byç badane jako substancje aktywne (s.a.) lub jako gotowe Szacowanie wyników badania dla agrochemikaformy u˝ytkowe. Jednak˝e niniejsze badanie nie ogra- liów opiera si´ na stosunkowo ma∏ych ró˝nicach nicza si´ tylko do substancji chemicznych omo˝liwym (tj. Êrednia wartoÊç ±25 %) pomi´dzy uwolnionym do przewidzenia st´˝eniu w Êrodowisku. Zmieniajàc dwutlenkiem w´gla lub zu˝ytym tlenem w kontroli zarówno iloÊç badanej substancji stosowanej do gleby, ipróbkach badanych, wi´c du˝e odchylenia wkontrojak i sposób opracowania danych, badanie mo˝e byç li mogà prowadziç do fa∏szywych wyników. Dlatego równie˝ wykonane w przypadku substancji chemicz- zmiennoÊç pomi´dzy powtórzeniami w kontroli ponych, co do których nie jest znana ich spodziewana winna wynosiç mniej ni˝ ±15 %. iloÊç w glebie. Dlatego dla substancji innych ni˝ agrochemikalia oznacza si´ wp∏yw serii st´˝eƒ na przemia- 1.6. Opis metody badawczej ny w´gla. Dane ztych badaƒ u˝ywane sà do wyznaczenia krzywej zale˝noÊci dawka-odpowiedê i wyliczenia 1.6.1. Wyposa˝enie wartoÊci EC, gdzie xjest zdefiniowanym % skutku. x Wbadaniu stosuje si´ naczynia testowe wykonane 1.2. Definicje z oboj´tnego chemicznie materia∏u. Powinny byç one odpowiedniej wielkoÊci wzale˝noÊci od zastosowanej Przemiany w´gla: to rozk∏ad przez mikroorgani- procedury inkubacji gleb, tj. inkubacji ca∏ej partii glezmy materii organicznej prowadzàcy do wytworzenia by lub jako seria poszczególnych próbek glebowych dwutlenku w´gla jako produktu koƒcowego. (zobacz pkt 1.7.1.2). Nale˝y poczyniç starania, by zminimalizowaç straty wody zjednej strony, azdrugiej by EC (St´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej umo˝liwiç wymian´ gazowà podczas badania (np. nax substancji w glebie powodujàcym x procent inhibicji czynia stosowane wbadaniu mogà byç nakryte perfoprzemian w´gla do dwutlenku w´gla. rowanà folià polietylenowà). Gdy badane sà substancje lotne, powinny byç stosowane szczelne i nieprze- EC 50 (Medialne st´˝enie efektywne): jest st´˝e- puszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieç takie niem badanej substancji wglebie powodujàcym 50 % rozmiary, by próbka gleby wype∏nia∏a w przybli˝eniu inhibicj´ przemian w´gla do dwutlenku w´gla. jednà czwartà ich obj´toÊci. 1.3. Substancje kontrolne Do oznaczenia oddychania indukowanego glukozà wymagane sà uk∏ady inkubacyjne oraz urzàdzenia do Brak. pomiarów wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu. Przyk∏ady takich uk∏adów iurzàdzeƒ sà opi- 1.4. Zasada metody badawczej sane w pozycji 8, 9, 10, 11 piÊmiennictwa. Do przesianej gleby dodaje si´ badanà substancj´ 1.6.2. Wybór i liczba gleb lub gleb´ pozostawia si´ bez dodatku badanej substancji (kontrola). Je˝eli badane sà agrochemikalia, to zale- Stosowana jest gleba jednego rodzaju. Zalecana ca si´ minimum dwa st´˝enia badanej substancji, które charakterystyka gleby jest nast´pujàca: powinny byç wybrane w odniesieniu do najwy˝szego st´˝enia, jakie przewiduje si´ w warunkach polowych. — zawartoÊç piasku: nie mniej ni˝ 50 % i nie wi´cej Po 0, 7, 14 i28 dniach inkubacji próbki gleby zsubstan- ni˝ 75 %,

— wartoÊç pH: 5,5—7,5, unikni´cie przechowywania w laboratorium, to gleby mogà byç przechowywane wciemnoÊci wtemperatu- — zawartoÊç w´gla organicznego: 0,5—1,5 %, rze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiàce. Podczas — biomasa mikroorganizmów powinna byç oznaczo- przechowywania gleby nale˝y zapewniç warunki tlena (zobacz pozycje 12 i 13 piÊmiennictwa), a za- nowe. Je˝eli gleby pobiera si´ z miejsc, gdzie sà one wartoÊç w´gla powinna stanowiç przynajmniej zamarzni´te przez przynajmniej trzy miesiàce w roku, 1 % ca∏kowitego w´gla organicznego gleby. to mo˝na rozwa˝yç przechowywanie ich próbek przez szeÊç miesi´cy w temperaturze –18 °C. Biomas´ mi- Gleba otakich w∏aÊciwoÊciach jest najbardziej nie- kroorganizmów wprzechowywanych glebach oznacza korzystnym przypadkiem, poniewa˝ adsorpcja bada- si´ przed ka˝dym doÊwiadczeniem. W´giel w biomanej substancji jest minimalna, ajej dost´pnoÊç dla mi- sie powinien stanowiç przynajmniej 1 % ca∏kowitego kroflory maksymalna. Dlatego badania z innymi gle- w´gla organicznego (zobacz pkt 1.6.2). bami ogólnie sà niepotrzebne. Jednak˝e w pewnych okolicznoÊciach, np. gdy przewidywane zastosowanie 1.6.4. Obróbka iprzygotowanie gleby przed badaniem badanej substancji b´dzie mia∏o miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaÊne gleby leÊne lub 1.6.4.1. Inkubacja wst´pna w przypadku substancji chemicznych na∏adowanych elektrostatycznie, konieczne mo˝e si´ okazaç zastoso- Je˝eli gleba by∏a przechowywana (zobacz wanie dodatkowej gleby. pkt1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3), zaleca si´ inkubacj´ wst´pnà przez odpowiedni okres wynoszàcy od 2 do 28 dni. 1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby Temperatura i wilgotnoÊç gleby podczas inkubacji wst´pnej powinny byç podobne do tych stosowanych 1.6.3.1. Pobieranie próbek gleby w badaniu (zobacz pkt 1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3). Dost´pne powinny byç szczegó∏owe informacje 1.6.4.2. Parametry fizykochemiczne dotyczàce historii miejsca, z którego pobierana jest gleba do badaƒ. Podaç nale˝y dok∏adne miejsce, ro- Gleb´ oczyszcza si´ r´cznie z du˝ych zanieczyszdzaj roÊlinnoÊci pokrywajàcej, daty zastosowania Êrod- czeƒ (np. kamieni, cz´Êci roÊlin) inast´pnie przesiewa ków ochrony roÊlin, zastosowanie nawozów organicz- do czàstek o rozmiarach równych lub mniejszych ni˝ nych i nieorganicznych, dodatki materia∏ów biologicz- 2 mm. WilgotnoÊç gleby powinna byç dostosowana nych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Miejsce, za pomocà wody destylowanej lub dejonizowanej do z którego pobiera si´ próby gleby do badaƒ, powinno wartoÊci pomi´dzy 40 i 60 % maksymalnej pojemnobyç tak dobrane, by umo˝liwiç d∏ugoterminowe jego Êci wodnej. u˝ycie. Odpowiednie sà pastwiska stale wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami zbó˝ (z wyjàt- 1.6.5. Przygotowanie badanej substancji w celu dodakiem kukurydzy) lub g´sto zasiane zielone ∏àki. Miejsce nia do gleby wybrane do pobierania próbek nie powinno byç podawane zabiegom z u˝yciem Êrodków ochrony roÊlin Badanà substancj´ podaje si´ z noÊnikiem. NoÊniprzez minimum jeden rok przed pobraniem próbek. kiem mo˝e byç woda (dla substancji rozpuszczalnych Ponadto przez przynajmniej szeÊç miesi´cy przed po- wwodzie) lub oboj´tna sta∏a substancja, taka jak drobbieraniem prób nie powinno stosowaç si´ ˝adnego na- ny piasek kwarcowy (rozmiar czàstek: 0,1—0,5mm). wozu organicznego. Zastosowanie nawozu mineralne- Nale˝y unikaç stosowania p∏ynnych noÊników innych go jest mo˝liwe tylko w przypadku wymagania tego ni˝ woda (np. rozpuszczalniki organiczne, takie jak przez roÊliny uprawne, apróbki gleby nie powinny byç aceton, chloroform), poniewa˝ mogà one zniszczyç pobierane wczeÊniej ni˝ trzy miesiàce po zastosowaniu mikroflor´. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ piasek, to nawozu. Nale˝y unikaç stosowania gleb, na których mo˝e on zawieraç badanà substancj´ rozpuszczonà stosowano nawozy o znanych skutkach dzia∏ania bio- lub zawieszonà w odpowiednim rozpuszczalniku. bójczego (np. cyjanamid wapnia). W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien byç usuni´ty przez odparowanie przed wymieszaniem Nale˝y unikaç pobierania próbek podczas lub tu˝ z glebà. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej po d∏ugich okresach suszy (wi´ksze ni˝ 30 dni) lub substancji w glebie zaleca si´ stosowanie 10 g piasku sp∏ywów wody. Wprzypadku gleb ornych próbki nale- na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrol- ˝y pobieraç zg∏´bokoÊci 0 do 20 cm. Wprzypadku ∏àk nych dodaje si´ takà samà iloÊç wody i/lub piasku. (pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie by∏a przeprowadzana przez d∏ugie okresy (przynajmniej jeden Badajàc substancje lotne, nale˝y na tyle, na ile to sezon), maksymalna g∏´bokoÊç pobierania próbek mo˝liwe unikaç strat podczas ich wprowadzania, mo˝e wynosiç nieco wi´cej ni˝ 20 cm (np. do 25 cm). a tak˝e nale˝y poczyniç starania, by w sposób jedno- Próbki gleby powinny byç transportowane wpojemni- rodny rozprowadziç substancj´ wglebie (np. substankach i temperaturze, które gwarantujà, ˝e pierwotne cja powinna zostaç podana do gleby w kilku miejw∏aÊciwoÊci gleby nie zostanà znaczàco zmienione. scach). 1.6.3.2. Przechowywanie próbek gleby 1.6.6. St´˝enia substancji badanej Najbardziej w∏aÊciwe jest stosowanie gleby Êwie- Je˝eli badane sà agrochemikalia lub inne substan- ˝o pobranej z pola. Je˝eli jednak nie ma sposobu na cje chemiczne o mo˝liwym do przewidzenia st´˝eniu

w Êrodowisku, to powinny byç zastosowane przynaj- winny zostaç dobrze wymieszane. Je˝eli gleby sà inmniej dwa st´˝enia. Ni˝sze st´˝enie powinno odpo- kubowane jako poszczególne próbki, to ka˝da z nich, wiadaç przynajmniej maksymalnej iloÊci spodziewa- zarówno kontrolna, jak izbadanà substancjà dzielona nej w glebie w warunkach praktycznych, natomiast jest na wymaganà liczb´ mniejszych próbek ite sà wywy˝sze st´˝enie powinno byç wielokrotnoÊcià st´˝e- korzystywane wed∏ug potrzeby. W doÊwiadczeniach nia ni˝szego. St´˝enia badanej substancji dodanej do gdzie przewiduje si´ wi´cej ni˝ dwa pobrania próbek gleby oblicza si´ przy za∏o˝eniu jednorodnego roz- do analizy, mniejsze próbki powinny byç przygotowamieszczenia do g∏´bokoÊci 5 cm i g´stoÊci gleby rów- ne w iloÊci wystarczajàcej dla wszystkich powtórzeƒ nej 1,5. W przypadku agrochemikaliów stosowanych we wszystkich punktach czasowych pobierania próbezpoÊrednio do gleby lub substancji chemicznych, bek. Powinny byç inkubowane przynajmniej trzy poktórych iloÊç w glebie mo˝na przewidzieç, zalecane wtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zobadane st´˝enia to maksymalne Przewidywane St´˝e- bacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badaƒ stosowanie wÂrodowisku (PEC) ijego pi´ciokrotnoÊç. Wprzy- ne powinny byç odpowiednie pojemniki o powierzchpadku substancji, które stosuje si´ kilkakrotnie w cza- ni pozwalajàcej na unikni´cie rozwoju warunków bezsie sezonu, badane st´˝enia wyznacza si´, mno˝àc tlenowych. Je˝eli badane sà substancje lotne, badania PEC przez maksymalnà przewidywanà liczb´ zastoso- nale˝y prowadziç z serià poszczególnych próbek. waƒ. Jednak˝e najwy˝sze stosowane st´˝enie nie powinno przekraczaç dziesi´ciokrotnoÊci maksymalnej 1.7.1.3. Warunki i czas trwania badania jednorazowo zastosowanej dawki. Badanie jest wykonywane w ciemnoÊci w tempe- Je˝eli badane sà substancje inne ni˝ agrochemikaraturze pokojowej 20±2 °C. WilgotnoÊç próbek gleby lia, nale˝y stosowaç geometrycznà seri´ pi´ciu st´˝eƒ. powinna byç utrzymywana w czasie badania pomi´- Badane st´˝enia powinny obejmowaç zakres konieczdzy 40 % a 60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej ny do wyznaczenia wartoÊci EC. x gleby (zobacz pkt 1.6.4.2) zodchyleniem ±5 %. Wmiar´ potrzeby mo˝na dodaç wod´ destylowanà lub dejo- 1.7. Wykonanie badania nizowanà. 1.7.1. Warunki nara˝enia Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni. Je˝eli badane sà agrochemikalia, to porównywane sà 1.7.1.1. St´˝enia substancji badanej i kontrola iloÊci uwolnionego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu wpróbkach kontrolnych izbadanà substancjà. Je- Je˝eli badane sà agrochemikalia, badanà próbk´ ˝eli w 28 dniu ró˝nià si´ one o wi´cej ni˝ 25 %, to bagleby dzieli si´ na trzy cz´Êci o równej masie. Dwie danie jest kontynuowane, a˝ osiàgnie si´ ró˝nic´ rówcz´Êci miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badany nà lub mniejszà ni˝ 25 % lub przez maksimum 100 dni produkt, a trzecià cz´Êç z noÊnikiem bez badanego w zale˝noÊci od tego, co nastàpi wczeÊniej. Dla subproduktu (kontrola). Zaleca si´ stosowanie minimum stancji innych ni˝ agrochemikalia badanie koƒczy si´ trzech powtórzeƒ dla st´˝eƒ i kontroli. W przypadku po 28 dniach. Po 28 dniach w próbkach kontrolnych badania substancji innych ni˝ agrochemikalia gleb´ igleby zbadanà substancjà oznacza si´ iloÊç uwolniodzieli si´ na szeÊç cz´Êci o równej masie. Pi´ç z nich nego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu i oblicza miesza si´ znoÊnikiem zawierajàcym badanà substanwartoÊci EC. cj´, a szóstà z noÊnikiem bez badanej substancji. Za- x równo dla kontroli, jak i badanych serii st´˝eƒ zaleca 1.7.2. Pobieranie próbek i analiza gleb si´ prowadzenie trzech powtórzeƒ. Nale˝y podjàç wszelkie starania w celu zapewnienia jednorodnego 1.7.2.1. Terminy pobierania próbek gleby rozprowadzenia badanej substancji wpróbkach gleby. Podczas mieszania nale˝y unikaç ubijania i zgniatania Je˝eli bada si´ agrochemikalia, to próbki gleby do gleby. analizy oddychania indukowanego glukozà pobiera 1.7.1.2. Inkubacja próbek glebowych si´ w 0, 7, 14 i 28 dniu. Je˝eli konieczne jest przed∏u- ˝enie badania, dalsze pomiary powinny byç wykony- Inkubacja próbek glebowych mo˝e byç przeprowa- wane w odst´pach 14-dniowych po 28 dniu. dzona na dwa sposoby: ca∏ej partii gleby z badanà substancjà i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem Je˝eli bada si´ substancje inne ni˝ agrochemikalia równych cz´Êci poszczególnych próbek gleby kontrol- to nale˝y stosowaç przynajmniej pi´ç st´˝eƒ, a oddynej izbadanà substancjà. Je˝eli badane sà substancje chanie indukowane glukozà w próbkach glebowych lotne, to badania nale˝y prowadziç zserià poszczegól- oznacza si´ na poczàtku (dzieƒ 0) i na koniec okresu nych próbek. Je˝eli inkubuje si´ ca∏e partie gleby, to nara˝enia (28 dzieƒ). Dodatkowy pomiar np. w 7 dniu nale˝y przygotowaç du˝à iloÊç próbek kontrolnych mo˝e byç równie˝ wykonany, je˝eli zostanie to uznane izbadanà substancjà, ˝eby podczas badania pobieraç za konieczne. Dane otrzymane 28 dnia sà u˝ywane do z nich ma∏e próbki do analizy. WyjÊciowa masa przy- wyznaczenia wartoÊci EC dla substancji chemicznej. x gotowanej gleby pierwotnej i w st´˝eniach zale˝y od Je˝eli jest to wymagane, to dane zpróbek kontrolnych rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby zasto- z dnia 0 mogà zostaç wykorzystane do podania posowanych powtórzeƒ w analizie oraz przewidywanej czàtkowej iloÊci metabolicznie aktywnej biomasy mimaksymalnej krotnoÊci pobierania. Gleby inkubowa- kroorganizmów w glebie (zobacz pozycja 12 piÊmienne wca∏oÊci przed pobieraniem próbek do analizy po- nictwa).

1.7.2.2. Oznaczanie oddychania indukowanego glukozà cedur (zobacz pozycje 15, 16 i 17 piÊmiennictwa) dla obliczonych wartoÊci EC wyznacza si´ tak˝e przedziax Oddychanie indukowane glukozà w ka˝dym po- ∏y ufnoÊci (p=0,95). wtórzeniu próbek zbadanà substancjà ikontroli oznacza si´ za ka˝dym razem podczas pobierania próbek. 2.2. Interpretacja wyników Próbki gleby miesza si´ zodpowiednià iloÊcià glukozy, by wywo∏aç natychmiastowà maksymalnà reakcj´ od- Je˝eli szacuje si´ wyniki z badania agrochemikadychania. IloÊç glukozy potrzebna do wywo∏ania mak- liów, a ró˝nica w oddychaniu pomi´dzy ni˝szà dawkà symalnej reakcji oddychania dla danej gleby mo˝e byç (tj. maksymalnym przewidywanym st´˝eniem w Êrooznaczona w badaniu wst´pnym przy zastosowaniu dowisku) a kontrolà jest równa lub ni˝sza ni˝ 25 % serii st´˝eƒ glukozy (zobacz pozycja 14 piÊmiennic- wjakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to twa). Zazwyczaj iloÊcià wystarczajàcà w przypadku produkt mo˝e zostaç scharakteryzowany jako niemagleby piaszczystej o 0,5—1,5 % zawartoÊci w´gla or- jàcy d∏ugoterminowego wp∏ywu na przemiany w´gla ganicznego jest 2000 mg do 4000 mg glukozy na kg w glebie. Przy szacowaniu wyników z badaƒ substansuchej masy gleby. Glukoza mo˝e byç zmielona do po- cji innych ni˝ agrochemikalia stosuje si´ wartoÊci staci proszku z czystym piaskiem kwarcowym EC, EC i/lub EC. 50 25 10 (10g piasku/kg suchej masy gleby) i w sposób jednorodny wymieszana z glebà. 3. SPRAWOZDANIE Próbki gleby z dodanà glukozà sà inkubowane Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´- w odpowiednim urzàdzeniu do ciàg∏ego pomiaru od- pujàce informacje: dychania, co godzin´ lub co dwie godziny (zobacz pkt1.6.1) w temperaturze 20±2 °C. Przez kolejnych Dok∏adna identyfikacja stosowanej gleby: 12 godzin oznacza si´ iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu, a pomiary powinny zaczàç — umiejscowienie geograficzne (d∏ugoÊç, szerosi´ jak najwczeÊniej, tj. w ciàgu 1 do 2 godzin po do- koÊç), daniu glukozy. Podczas 12 godzin mierzy si´ ca∏kowite iloÊci wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego — informacje ohistorii miejsca (tj. rodzaj roÊlinnoÊci tlenu i oznacza si´ Êrednià wartoÊç oddychania. pokrywajàcej, zastosowane Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia itp.), 2. WYNIKI — zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leÊna itp.), 2.1. Obliczanie wyników — g∏´bokoÊç pobierania gleby (cm), — zawartoÊç piasku/i∏u/gliny (% suchej masy), Je˝eli badanie wykonuje si´ z agrochemikaliami, to iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego — wartoÊç pH (w wodzie), tlenu w ka˝dej próbce powinna byç zapisana, a Êrednie wartoÊci ze wszystkich powtórzeƒ powinny zostaç — zawartoÊç w´gla organicznego (% suchej masy), zestawione w formie tabeli. Wyniki powinny zostaç oszacowane za pomocà odpowiedniej i ogólnie uzna- — zawartoÊç azotu (% suchej masy), nej metody statystycznej (np. test F, poziom istotnoÊci 5 %). Oddychanie indukowane glukozà wyra˝a si´ — poczàtkowe st´˝enie azotanów (mg azotanów/kg wmg dwutlenku w´gla/kg suchej masy gleby/godzin´ suchej masy), lub w mg tlenu/kg suchej masy gleby/godzin´. Âred- — zdolnoÊç wymiany jonowej (mmol/kg), nià iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu w ka˝dym st´˝eniu porównuje si´ z iloÊcià — biomasa mikroorganizmów wyra˝ona w procenw glebie kontrolnej i oblicza si´ procent odchylenia tach ca∏kowitej zawartoÊci w´gla organicznego, wzgl´dem kontroli. — metody stosowane do oznaczenia ka˝dego para- Je˝eli badanie wykonywane jest dla substancji in- metru, nych ni˝ agrochemikalia, to okreÊla si´ iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu w ka˝- — wszystkie informacje dotyczàce pobierania i przedym powtórzeniu i dla oszacowania wartoÊci EC wy- chowywania próbek, x znacza si´ krzywà zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Oddy- — szczegó∏y dotyczàce wst´pnej inkubacji gleby. chanie indukowane glukozà (tj. mg dwutlenku w´- gla/kg suchej masy gleby/godzin´ lub w mg tlenu/kg Badana substancja: suchej masy gleby/godzin´) oznaczone w próbkach z badanà substancjà po 28 dniach jest porównywane — postaç fizyczna i istotne w∏aÊciwoÊci fizykochez kontrolà. Z tych danych oblicza si´ procent inhibicji miczne, dla ka˝dego st´˝enia. WartoÊci wyra˝one w procentach nale˝y korelowaç z odpowiednimi st´˝eniami. — nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystoÊç Procedury statystyczne powinny umo˝liwiç obliczenie (tj. dla Êrodków ochrony roÊlin procent substancji wartoÊci EC x. Przy zastosowaniu standardowych pro- aktywnej), zawartoÊç azotu.

Warunki badania: 4) SETAC — Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pestici- — szczegó∏y dotyczàce wzbogacenia gleby substra- des, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC — Europe, Brustem organicznym, sels. — liczba st´˝eƒ badanej substancji i uzasadnienie 5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop wyboru st´˝eƒ, on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18—20 January 1995. — szczegó∏y dotyczàce podania badanej substancji 6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Gudo gleby, idance on the collection, handling and storage of — temperatura inkubacji, soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 Ja- — wilgotnoÊç gleby na poczàtku i podczas trwania koÊç gleby — Pobieranie próbek — Zasady dotybadania, czàce pobierania, post´powania zpróbkami iprzechowywania próbek gleby przeznaczonych do ba- — zastosowana metoda inkubacji gleby (ca∏a partia dania tlenowych (aerobowych) procesów mikrogleby, czy jako seria poszczególnych próbek gle- biologicznych w warunkach laboratoryjnych. by), 7) Anderson J. P. E. (1987). Handling and Storage of — informacja o tym, ile razy pobierano próbki, Soils for Pesticides Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and — czas pobrania próbek. M. P. Greaves, Chap. 3: 45—60. 8) Anderson J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Me- Wyniki: thods of Soil Analysis — Part 2: Chemical and Mi- — metoda i sprz´t stosowany do pomiarów respira- crobiological Properties”. Agronomy Monograph N° 9. Eds. A. L. Page, R.H. Miller and D. R. Keeney. cji, 41: 831—871. — dane zawierajàce poszczególne wyniki i wartoÊci 9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality — Guidance on Êrednie pomiarów dwutlenku w´gla lub tlenu Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: w formie tabel, Part1. Aerobic Conditions. PN-ISO 11266:1997 JakoÊç gleby — Zasady prowadzenia badaƒ labora- — odchylenia pomi´dzy powtórzeniami w próbkach toryjnych nad biodegradacjà zwiàzków organiczz badanà substancjà i kontrolnych, nych w glebie w warunkach tlenowych. — wyjaÊnienia poprawek w obliczeniach, je˝eli by∏y 10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory inkonieczne, cubation systems for measuring mineralisations of organic chemicals in soil under aerobic condi- — odchylenia w oddychaniu indukowanym glukozà tions. PN-ISO 14239:2000 JakoÊç gleby — Laboraw ka˝dym czasie pobierania próbek wyra˝one toryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizaw procentach lub w postaci wartoÊci EC z 95 % 50 cji zwiàzków organicznych w glebie w warunkach przedzia∏ami ufnoÊci, inne wartoÊci EC (tj. EC x 25 tlenowych. lub EC) zprzedzia∏ami ufnoÊci oraz wykres krzy- 10 wej zale˝noÊci dawka-odpowiedê, 11) Heinemeyer O., Insam H., Kaiser E. A. and Walenzik G. (1989). Soil microbial biomass and respira- — statystyczne opracowanie wyników, je˝eli jest kotion measurements; an automated technique banieczne, sed on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77—81. — wszystkie informacje iobserwacje pomocne winterpretacji wyników. 12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 1: Substrate — 4. PIÂMIENNICTWO induced respiration method. PN-ISO 14240-1:2001 JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikro- 1) EPPO (1994). Decision — Making Scheme for the organizmów w glebie — Metoda indukcji oddy- Environmental Risk Assessment of Plant Protecchania przez dodanie substratu. tion Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1—16, 1994. 13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of microbial biomass — Part 2: Fumigation — 2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Mi- extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 JakoÊç croflora. BBA Guidelines for the Official Testing of gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorgani- Plant Protection Products, VI, 1—1 (2ndeds., 1990). zmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji. 3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity 14) Malkomes H.P. (1986). Einfluß von Glukosemenge Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. Sep- Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am tember 28, 1987. Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount

of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pe- ments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, sticides in Short-Term Respiration, using a Herbi- 99—113. cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflan- 16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Camzenschutzd., Braunschweig, 38: 113—120. bridge, London and New York. 15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon F. (1949). A simpli- 17) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biologified method of evaluating dose — effect experi- cal Assay. Griffin, Weycombe, UK. Za∏àcznik nr 13 C.23. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W GLEBIE 1. METODA Produkty przemian: wszystkie substancje pochodzàce zreakcji przemian biotycznych lub abiotycznych Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- badanej substancji, w tym CO i produkty, które sà 2 sanej w Wytycznej OECD nr 307 (2002). w zwiàzanych pozosta∏oÊciach. 1.1. Wst´p Zwiàzane pozosta∏oÊci: „Zwiàzane pozosta∏oÊci” stanowià zwiàzki wglebie, roÊlinie lub zwierz´ciu, któ- Niniejsza metoda badawcza opiera si´ na istniejàre trwajà w matrycy w postaci zwiàzku wyjÊciowego cych wytycznych (zobacz pozycje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i9 lub jego metabolitów/produktów przemian po ekstrakpiÊmiennictwa). Badanie wykonane wg niniejszej mecji. Metoda ekstrakcji nie powinna znaczàco zmieniaç tody ma na celu oszacowanie tlenowych i beztlenosamych zwiàzków lub struktury matrycy. Sposób wiàwych przemian substancji chemicznych w glebie. Dozania mo˝e byç cz´Êciowo wyjaÊniony przez zmian´ Êwiadczenie wykonuje si´, aby okreÊliç (i) stopieƒ sposobu ekstrakcji z matrycy lub wyspecjalizowane przemian badanej substancji i (ii) rodzaj i iloÊci potechniki analityczne. W taki sposób zidentyfikowano wstajàcych i ulegajàcych rozk∏adowi produktów przena przyk∏ad wiàzania kowalencyjne jonowe i sorpcyjmian, na które mogà byç nara˝one organizmy glebone, a tak˝e „pu∏apki”. Ogólnie tworzenie zwiàzanych we iroÊliny. Takie badania sà wymagane dla substanpozosta∏oÊci redukuje znaczàco biodost´pnoÊç i biocji chemicznych bezpoÊrednio stosowanych do gleby przyst´pnoÊç (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa) lub dla tych, które z du˝ym prawdopodobieƒstwem [zmodyfikowane wed∏ug IUPAC 1984 r. (zobacz pozyosiàgnà Êrodowisko glebowe. Wyniki takich badaƒ lacja 13 piÊmiennictwa)]. boratoryjnych mogà byç tak˝e wykorzystane przy opracowywaniu metod pobierania próbek i ich anali- Przemiany tlenowe: reakcje zachodzàce w obeczy w badaniach polowych. noÊci tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 14 pi- Badania tlenowe ibeztlenowe przeprowadzane na Êmiennictwa). jednym rodzaju gleby sà na ogó∏ wystarczajàce do oszacowania szlaków przemian (zobacz pozycje 8, 10 Przemiany beztlenowe: reakcje zachodzàce pod i 11 piÊmiennictwa). Stopieƒ przemian powinien byç nieobecnoÊç tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 14 oszacowany przynajmniej wtrzech rodzajach gleb (zo- piÊmiennictwa). bacz pozycje 8 i 10 piÊmiennictwa). Gleba:jest mieszaninà mineralnych ichemicznych Na Warsztatach OECD dotyczàcych wyboru gleb organicznych sk∏adników, przy czym te drugie sk∏adai osadów, które odbywa∏y si´ we W∏oszech, Belgirate jà si´ ze zwiàzków o wysokiej zawartoÊci w´gla i azow 1995 r. (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa), uzgodtu i o du˝ych masach czàsteczkowych, o˝ywionych niono liczb´ irodzaje gleb, które mogà byç stosowane przez ma∏e (najcz´Êciej mikro-) organizmy. Gleby mow badaniu. Rodzaje badanych gleb powinny byç regà znajdowaç si´ w dwóch stanach: prezentatywne dla regionu, wktórym nastàpi zastosowanie lub uwolnienie substancji. Na przyk∏ad sub- a) niewzruszony, czyli tak jak gleba rozwija∏a si´ stancje, które b´dà stosowane w regionach tropikal- w czasie z charakterystycznymi pow∏okami ró˝- nych i subtropikalnych, powinny byç badane na gle- nych jej rodzajów, bach typu Ferrasol iNitosol (wed∏ug klasyfikacji FAO). Na Warsztatach podj´to tak˝e zalecenia wzakresie po- b) wzruszony, czyli taki, który dotyczy gleb uprawiabierania, opracowania i przechowywania próbek gle- nych lub wtedy gdy pobiera si´ próbki przez wybowych na bazie Wytycznych ISO (zobacz pozycja 15 kopywanie istosuje wniniejszej metodzie (zobacz piÊmiennictwa). Wmetodzie uwzgl´dnia si´ tak˝e sto- pozycja 14 piÊmiennictwa). sowanie gleb spod upraw ry˝owych. Mineralizacja: jest pe∏nym rozk∏adem zwiàzku or- 1.2. Definicje ganicznego do CO i H O w warunkach tlenowych 2 2 oraz CH, CO i H O w warunkach beztlenowych. 4 2 2 Badana substancja:ka˝da substancja, wtym zwià- W kontekÊcie niniejszej metody gdy stosuje si´ zwiàzek wyjÊciowy i odpowiednie produkty przemian. zek znakowany 14C, mineralizacja oznacza rozk∏ad,

Granica wykrywalnoÊci (LOD) metody analitycznej — materia∏y do absorpcji na cia∏o sta∏e, takie jak pobadanej substancji i produktów przemiany powinna liuretany lub wapno sodowe, wynosiç przynajmniej 0,01 mg/kg gleby (jako badana substancja) lub 1 % zastosowanej dawki, wzale˝noÊci — rozpuszczalniki analityczne czystoÊci analitycznej, która zwartoÊci jest ni˝sza. Powinno si´ tak˝e okreÊliç takie jak aceton, metanol itp., granic´ oznaczalnoÊci (LOQ). — ciecz do scyntylacji. 1.7.3. Dok∏adnoÊç danych przemian 1.8.2. Zastosowanie badanej substancji Analiza regresji st´˝eƒ badanej substancji jako W celu dodania do gleby i rozprowadzenia w niej funkcja czasu daje w∏aÊciwà informacj´ o wiarygodbadanej substancji nale˝y t´ substancj´ rozpuÊciç noÊci krzywej przemian i pozwala na obliczenie przewwodzie (dejonizowanej lub destylowanej) lub gdy to dzia∏ów ufnoÊci dla okresów pó∏rozk∏adu (w przypadkonieczne wminimalnej iloÊci acetonu lub innych rozku reakcji zachodzàcej wg kinetyki pseudopierwszego puszczalników organicznych (zobacz pozycja 6 pirz´du) lub wartoÊci DT i, je˝eli to w∏aÊciwe, tak˝e 50 Êmiennictwa), w których badana substancja jest wywartoÊci DT i DT. 75 90 starczajàco rozpuszczalna i trwa∏a. Jednak˝e iloÊç wykrywanego rozpuszczalnika nie powinna mieç znaczà- 1.8. Opis metody badawczej cego wp∏ywu na aktywnoÊç mikrobiologicznà gleby (zobacz pkt 1.5 ipkt 1.9.2—1.9.3). Nale˝y unikaç stoso- 1.8.1. Sprz´t i odczynniki wania rozpuszczalników hamujàcych aktywnoÊç mikrobiologicznà, takich jak chloroform, dichlorometan Systemy inkubacyjne sk∏adajà si´ z uk∏adów stai inne rozpuszczalniki halogenowane. tycznych zamkni´tych lub z odpowiednich uk∏adów przep∏ywowych (zobacz pozycje 7 i17 piÊmiennictwa). Badana substancja mo˝e byç tak˝e dodana w po- Przyk∏ady uk∏adów przep∏ywowych dla gleby ibiomestaci cia∏a sta∏ego, np.: zmieszana z piaskiem kwarcotrycznych kolb przedstawiono odpowiednio na rysunwym (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) lub w ma∏ej kach C.23.1 i C.23.2. Obydwa rodzaje systemów inkupróbce gleby, która zosta∏a wysuszona na powietrzu bacji majà swoje wady i zalety (zobacz pozycje 7 i 17 iwyja∏owiona. Je˝eli badanà substancj´ dodaje si´ za piÊmiennictwa). pomocà rozpuszczalnika, to nale˝y doprowadziç do wyparowania rozpuszczalnika przed dodaniem do Wymagany jest standardowy sprz´t laboratoryjny, próbki gleby inast´pnie do ca∏ej niesterylnej gleby do a w szczególnoÊci: badania. — instrumenty analityczne, takie jak GLC, HPLC, TLC Dla ogó∏u substancji chemicznych, których g∏ówny wraz z odpowiednimi systemami detekcji do anaszlak dostawania si´ do gleby to osady Êciekowe/dzializowania substancji znakowanych lub nieznako- ∏alnoÊç rolnicza, badanà substancj´ powinno si´ najwanych lub do metody rozcieƒczeƒ inwertowapierw dodaç do osadu, a nast´pnie wprowadziç do nych izotopów, próbki gleby (zobacz pkt 1.9.2 i pkt 1.9.3). — instrumenty dla celów identyfikacyjnych (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR), Nie zaleca si´ stosowania produktów w postaci gotowych formulacji. Jednak w przypadku substancji — licznik scyntylacyjny, o s∏abej rozpuszczalnoÊci zastosowanie materia∏u w formulacji mo˝e byç w∏aÊciwà alternatywà. — utleniacz dla spalania materia∏u radioaktywnego, 1.8.3. Gleby — wirówka, 1.8.3.1. Wybór gleby — sprz´t do ekstrakcji (na przyk∏ad probówki wirówkowe do zimnej ekstrakcji i aparat Soxhleta do Aby okreÊliç szlak przemian, stosowaç mo˝na glemetody ekstrakcji ciàg∏ej), b´ reprezentatywnà; zalecane jest stosowanie gleby — sprz´t do zat´˝ania roztworów i ekstraktów (np. piaszczysto-ilastej lub gliniasto-ilastej, lub ilastej, lub wyparka obrotowa), ilasto-piaskowej [wed∏ug klasyfikacji FAO i USDA (zobacz pozycja 18 piÊmiennictwa)] o wartoÊci pH — ∏aênia wodna, w granicach 5,5—8,0, zawartoÊci w´gla organicznego 0,5—2,5 % i masie mikroorganizmów przynaj- — urzàdzenia do mieszania mechanicznego. mniej odpowiadajàcej 1 % ogólnego w´gla organicznego (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). Stosowane odczynniki chemiczne to na przyk∏ad: W badaniach stopnia przemian stosowaç nale˝y — NaOH czystoÊci analitycznej, 2 mol/dm3 lub inna przynajmniej trzy dodatkowe rodzaje gleb, reprezentaw∏aÊciwa zasada (np. KOH, etanoloamina), tywne dla zakresu odpowiednich gleb. Gleby powinny — H SO czystoÊci analitycznej, 0,05 mol/dm3, ró˝niç si´ co do zakresu zawartoÊci w´gla organiczne- 2 4 go, wartoÊci pH, zawartoÊci gliny i mikroorganizmów — glikol etylenowy czystoÊci analitycznej, (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

podawanych na liÊcie lub do gleby, bez inkorporacji, ca, nast´pnie wokresie po pierwszym miesiàcu wod- 2,5 cm jest w∏aÊciwà g∏´bokoÊcià do obliczenia iloÊci st´pach 17-dniowych) podczas badania i pod koniec substancji w ka˝dej kolbce. Dla substancji wnikajà- okresu inkubacji ka˝dej próbki ianalizuje si´ na zawarcych w gleb´ w∏aÊciwà g∏´bokoÊcià jest ta podana na toÊç substancji lotnych. Oprócz próbki gleby pobranej etykiecie. Ogólnie dla substancji chemicznych dawka bezpoÊrednio przed podaniem materia∏u badanego powinna byç oszacowana na podstawie najbardziej (dzieƒ 0) do∏àczyç nale˝y przynajmniej pi´ç próbek poznaczàcego sposobu jej przenikania do gleby; na przy- branych wdodatkowych terminach. Odst´py czasowe k∏ad gdy sposobem dostawania si´ do gleby sà osady nale˝y dobraç w taki sposób, aby mo˝na by∏o ustaliç Êciekowe, to substancja powinna byç dawkowana model rozpadu badanej substancji i model rozpadu w osadach w st´˝eniu, które b´dzie odzwierciedlaç i tworzenia produktów przemiany (np.: dni 0, 1, 3, 7; spodziewane st´˝enie wosadzie iiloÊç osadu dodane- tygodnie 2, 3; miesiàce 1, 2, 3). go do gleby ozastosowaniu rolniczym. Je˝eli to st´˝enie nie jest na tyle wysokie, aby pozwoliç na okreÊle- Je˝eli stosuje si´ substancj´ znakowanà 14C to ranie g∏ównych produktów przemian, to pomocna mo˝e dioaktywnoÊç, która nie jest ekstrahowalna, b´dzie byç inkubacja dodatkowych próbek gleby o zwi´kszo- okreÊlona przez spalanie. Bilans masy oblicza si´ dla nej dawce, ale nale˝y unikaç zbyt du˝ych dawek wp∏y- ka˝dego czasu pobierania próbek. wajàcych na funkcjonowanie mikroorganizmów glebowych (zobacz pkt 1.5 i pkt 1.8.2). W przypadku inkubacji w warunkach beztlenowych i w przypadku poletka ry˝owego faz´ glebowà Alternatywnie do wi´kszej partii (tj. 1 do 2 kg) gle- iwodnà analizuje si´ na zawartoÊç badanej substancji by mo˝na dodawaç badanà substancj´, którà nale˝y iproduktów przemian razem lub osobno przez filtracj´ ostro˝nie wymieszaç we w∏aÊciwym urzàdzeniu mie- lub odwirowanie przed ekstrakcjà i oznaczaniem. szajàcym i nast´pnie przenieÊç w ma∏ych porcjach 50do 200 g do kolbek inkubacyjnych (na przyk∏ad za 1.9.4. Badania opcjonalne pomocà rozdzielaczy prób). Ma∏e iloÊci (np. 1 g) z gleby traktowanej w ca∏ej partii powinno si´ analizowaç Przy ustalaniu wp∏ywu temperatury i wilgotnoÊci na zawartoÊç badanej substancji celem upewnienia gleby na stopieƒ przemian badanej substancji i/lub jej si´ o jej jednorodnym rozproszeniu. Preferuje si´ taki produktów przemian wglebie pomocne mogà byç basposób post´powania, poniewa˝ pozwala on na bar- dania w warunkach tlenowych, niesterylnych w dodziej jednorodne rozprowadzenie badanej substancji datkowych temperaturach i wilgotnoÊciach gleby. w glebie. Mo˝na dokonaç charakterystyki radioaktywnej cz´Êci, nieulegajàcej ekstrakcji, np. wykorzystujàc me- Próbki gleby bez badanej substancji inkubuje si´ tod´ nadkrytycznej ekstrakcji fluidalnej. w takich samych warunkach (tlenowych), jak próbki z badanà substancjà. Próbki te wykorzystuje si´ do 2. WYNIKI oznaczeƒ biomasy pod koniec badania. 2.1. Opracowanie wyników Gdy badanà substancj´ dodaje si´ do gleby w postaci rozpuszczonej w rozpuszczalnikach organicz- IloÊci badanej substancji, produktów przemian, nych, do próbek gleby dodaje si´ takà samà iloÊç rozsubstancji lotnych (wyra˝one tylko w %) i nieulegajàpuszczalnika i inkubuje w takich samych warunkach cych ekstrakcji pozosta∏oÊci powinny byç wyra˝one ja- (tlenowych), jak próbki z badanà substancjà. W celu ko % stosowanego st´˝enia poczàtkowego i gdy to ustalenia wp∏ywu rozpuszczalnika na biomas´ mikrow∏aÊciwe wpostaci mg/kg gleby (wprzeliczeniu na suorganizmów próbki te wykorzystuje si´ do oznaczeƒ chà mas´ gleby) dla ka˝dego okresu pobierania prób. biomasy na poczàtku, podczas i pod koniec badania. Bilans masy dla ka˝dego czasu pobierania prób nale- ˝y przedstawiç jako procent stosowanego st´˝enia po- Probówki zawierajàce gleb´ z badanà substancjà czàtkowego. Graficzne przedstawienie st´˝eƒ badanej sà tak˝e do∏àczane do systemu przep∏ywowego opisa- substancji wzgl´dem czasu pozwala na oszacowanie nego na rysunku C.23.1 lub zamykane kolumnà ab- jej pó∏okresu przemian lub wartoÊci DT. Nale˝y zi- 50 sorpcyjnà przedstawionà na rysunku C.23.2 (zobacz dentyfikowaç g∏ówne produkty przemian, a ich st´˝e- Schemat). nia powinny byç przedstawione na wykresie wzgl´- dem czasu w celu wykazania ich wytworzonych iloÊci 1.9.3. Pobieranie prób i pomiary oraz rozpadu. G∏ównym produktem przemian jest ka˝- dy produkt stanowiàcy ≥10 % zastosowanej dawki Podwójne serie kolb inkubacyjnych usuwa si´ we w jakimkolwiek czasie podczas badania. w∏aÊciwych odst´pach czasowych, a próbki gleby poddaje si´ ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnika- Zwiàzane produkty lotne dajà pewnà wiedz´ na temi o ró˝nej polarnoÊci i analizuje na zawartoÊç bada- mat potencja∏u do lotnoÊci badanej substancji i jej nej substancji i/lub produktów przemian. Dobrze za- produktów przemian z gleby. projektowane badanie zapewnia wystarczajàcà iloÊç kolb, tak aby u˝ywaç dwóch kolb w ka˝dym badaniu Bardziej dok∏adne oszacowania okresów pó∏rozpróbki. Usuwa si´ tak˝e roztwory absorpcyjne lub sta- k∏adu lub wartoÊci DT i, je˝eli to w∏aÊciwe, wartoÊci 50 ∏e materia∏y absorpcyjne w ró˝nych odst´pach czaso- DT i DT powinno si´ otrzymaç przez zastosowanie 75 90 wych (7-dniowe odst´py podczas pierwszego miesià- odpowiedniego modelu obliczeƒ kinetycznych. Warto-

Êci okresów pó∏rozk∏adu lub wartoÊci DT powinny Substancja kontrolna: 50 byç przedstawione wraz zopisem zastosowanego mo- — nazwa chemiczna istruktura substancji kontrolnej delu, rz´dowoÊci kinetyki reakcji i okreÊleniem wspó∏- czynnika (r2). Preferuje si´ kinetyk´ pierwszego rz´du, stosowanej do opisu i/lub identyfikacji produktu dopóki r2<0,7. Gdy to w∏aÊciwe, to obliczenia nale˝y przemiany. tak˝e przedstawiç dla g∏ównych produktów przemian. Badane gleby: Przyk∏ady odpowiednich modeli sà opisane w pozycjach 31, 32, 33, 34 i 35 piÊmiennictwa. — szczegó∏y dotyczàce miejsca pobrania, W przypadku badaƒ wykonywanych w ró˝nych — data i sposób pobrania, temperaturach stopieƒ przemiany powinien byç opi- — w∏aÊciwoÊci gleby, takie jak: wartoÊç pH, zawarsany wpostaci funkcji temperatury wzakresie tempetoÊç w´gla organicznego, sk∏ad (% piasku, % i∏u, % ratur doÊwiadczalnych przy zastosowaniu równania gliny), zdolnoÊç wymiany jonów, g´stoÊç ogólna, Arrheniusa: retencja wody, biomasa mikroorganizmów, — d∏ugoÊç okresu przechowywania i warunki przechowywania (je˝eli by∏a przechowywana). gdzie: Warunki badania: — lnAiBsà sta∏ymi regresji odpowiednio przeci´- ciem i nachyleniem najdok∏adniej dopasowanej — daty wykonania badania, linii powsta∏ej po liniowej regresji ln k wzgl´- dem 1/T, — iloÊç dodanej badanej substancji, — k jest sta∏à w temperaturze T, — stosowane rozpuszczalniki i metoda zaaplikowania badanej substancji, — T jest temperaturà wyra˝ona w kelwinach. — masa gleby traktowanej na poczàtku badania ipobieranej w ka˝dym interwale czasowym, Nale˝y wziàç pod uwag´ wàski zakres temperatur, w którym równanie Arrheniusa jest spe∏nione, gdy — opis stosowanego systemu inkubacyjnego, przemiany sà powodowane aktywnoÊcià mikroorganizmów. — iloÊci przep∏ywajàcego powietrza (tylko dla systemów przep∏ywowych), 2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników — temperatura w czasie doÊwiadczenia, Chocia˝ badania wykonywane sà w sztucznym — wilgotnoÊç gleby podczas inkubacji, uk∏adzie laboratoryjnym, to wyniki pozwalajà na oszacowanie stopnia przemian badanej substancji oraz — poczàtkowa biomasa mikroorganizmów, nast´pstopnia tworzenia i rozpadu produktów przemian nie podczas badania ina koniec wwarunkach tlew warunkach polowych (zobacz pozycje 36 i 37 pi- nowych, Êmiennictwa). — wartoÊç pH, st´˝enie tlenu i potencja∏ red-oks na poczàtku badania, podczas i na koniec badania Badanie szlaków przemian substancji dostarcza inw warunkach beztlenowych i poletka ry˝owego, formacji o sposobie zmian strukturalnych badanej substancji w glebie na drodze reakcji chemicznych — metody ekstrakcji, i mikrobiologicznych. — metody oznaczania iloÊciowego i identyfikacji ba- 3. SPRAWOZDANIE danej substancji i g∏ównych produktów przemian w glebie i materia∏ach absorpcyjnych, Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´- — liczba powtórzeƒ i liczba kontroli. pujàce informacje: Wyniki: Badana substancja: — wyniki oznaczenia aktywnoÊci mikrobiologicznej, — nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny (wskazujàc pozycj´ znacz- — powtarzalnoÊç i czu∏oÊç stosowanych metod ananików, gdy stosowano materia∏ znakowany radio- litycznych, aktywnie) i wa˝ne w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (zobacz pkt 1.5), — stopieƒ odzysku (wartoÊci % dla zwalidowanego badania podano w pkt 1.7.1), — czystoÊç (zanieczyszczenia) badanej substancji, — tabelaryzowane wyniki wyra˝one jako % stosowa- — czystoÊç radiochemiczna znakowanego zwiàzku nej poczàtkowej dawki i, gdy to w∏aÊciwe, jako i specyficzna aktywnoÊç (gdy to w∏aÊciwe). mg/kg gleby (na podstawie suchej masy),

— bilans masy podczas i na koniec badania, organic chemicals in soil under aerobic conditions. PN-ISO 14239:2000 JakoÊç gleby — Labora- — opis nieekstrahowalnej (zwiàzanej) radioaktywno- toryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizacji Êci lub pozosta∏oÊci w glebie, zwiàzków organicznych wglebie wwarunkach tlenowych. — iloÊciowe oznaczenie uwolnionego CO i innych 2 lotnych zwiàzków, 8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark — wykresy st´˝eƒ glebowych wzgl´dem czasu dla R. Lynch, Ed. badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian, 9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil — Aerobic — okres pó∏rozk∏adu lub DT, DT i DT dla bada- 50 75 90 metabolism study in soil under paddy field condinej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych tions (flooded). produktów przemian wraz z przedzia∏ami ufnoÊci, 10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop — oszacowanie stopnia degradacji abiotycznej on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, w warunkach sterylnych, 18—20 January 1995. — oszacowanie kinetyki przemian dla badanej sub- 11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In stancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produk- Interactions between Herbicides and the Soil tów przemian, (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123—157. — proponowane szlaki przemian, gdy to w∏aÊciwe, 12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH (1998). — dyskusja i interpretacja wyników, 13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in — dane pierwotne (tj. wybrane chromatogramy, wysoils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945—956 brane obliczenia stopnia przemian i sposoby (IUPAC 1984). identyfikacji produktów przemian). 14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegrada- 4. PIÂMIENNICTWO bility in Soil (adopted 12 May 1981). 1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pe- 15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling — sticide Assessment Guidelines, Subdivision Part 6: Guidance on the collection, handling and N. Chemistry: Environmental Fate. storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381- 2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemi- -6:1998 JakoÊç gleby — Pobieranie próbek — Zastry and Fate. Guidelines for registration of pestisady dotyczàce pobierania, post´powania z próbcides in Canada. kami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) proce- 3) European Union (EU) (1995). Commission Directisów mikrobiologicznych w warunkach laboratove 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Diryjnych. rective 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, 16) Annex V to Dir. 67/548/EEC. PartAand Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment. 17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress 4) Dutch Commission for Registration of Pesticides in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Ro- (1995). Application for registration of a pesticide. berts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85—114. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. 5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4—1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden-Abbau, 19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical Umwandlung und Metabolismus. and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality-Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic che- 20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical micals in soil — Part 1: Aerobic conditions. PN-ISO and Microbiological Properties. A.L. Page, 11266:1997 JakoÊç gleby — Zasady prowadzenia R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Sebadaƒ laboratoryjnych nad biodegradacjà zwiàz- ries No 9, 2nd Edition. ków organicznych w glebie w warunkach tlenowych. 21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality — General aspects; chemical and 7) ISO 14239 (1997). Soil Quality-Laboratory incuba- physical methods of analysis; biological methods tion systems for measuring the mineralization of of analysis. First Edition.

22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ih- crobiology and Soil Quality, 68—69 (SETAC-Eurore geologischen, geomorphologischen, mineralo- pe). gischen und petrologischen Grundlagen. DLG- -Verlag, Frankfurt, Main. 30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content 23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch and some chemical characteristics. Plant and Soil der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. 102, 197—200. 24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) Aphysiolo- 31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur gical method for the quantitative measurement of und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlemicrobial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, gung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, 215—221. Sonderheft VII, 141—146. 25) ISO 14240–1 and 2 (1997). Soil Quality — Determi- 32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathenation of soil microbial biomass – Part 1: Substra- matical modelling to the soil persistence and acte-induced respiration method. Part 2: fumigation- cumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: -extraction method. PN-ISO 14240-1:2001 JakoÊç Persistence of Insecticides and Herbicides, 181— gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorgani- 199. zmów w glebie — Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu. PN-ISO 14240-2:2001 Ja- 33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., koÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroor- Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degraganizmów w glebie — Metoda fumigacji — eks- dation in soil. In „Environmental Dynamics of Petrakcji. sticides”. R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135—172. 26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Ef- 34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical fects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Gre- interpretation and graphic representation of the aves, Eds. Taylor & Francis, 45—60. degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz—Nachrichten Bayer 39, 188–204. 27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and 35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretabiotransformation of pesticides in aqueous envi- tion and graphic representation of the degradatioronment. Proceedings of the 16th Symposium on nal behaviour of pesticide residues. I. Pflanzen- Environmental Science of Pesticide, 105—120. schutz—Nachrichten Bayer 33, 47—60. 28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of 36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pestorage on biochemical processes in soil. In Pesti- sticide dissipation in soil; a new model based on cides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59—63 spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, (SETAC-Europe). 1032—1041. 29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl- 37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its pre- -Svensson K., StenströmJ., Torstensson L. (1996). diction. In Interactions between Herbicides and Effect of freeze and cold storage of soil on micro- the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, bial activities and biomass. In Pesticides, Soil Mi- 83—122.

TABELA C.23.1 PR¢˚NOÂå WODY, POJEMNOÂå POLOWA (FC) I CA¸KOWITA POJEMNOÂå WODNA (WHC)1) (a)pF = log cm s∏upa wody. (b)1 bar = 105Pa. (c)Odpowiada przybli˝onej 10 % zawartoÊci wody wpiasku, 35 % wile i45 % wglinie. (d)PojemnoÊç polowa nie jest sta∏a, ale waha si´ wzale˝noÊci od rodzaju gleby pomi´dzy pF 1,5 i2,5. CiÊnienie ssania glebyjest mierzone wcm s∏upa wody lub wbarach. Ze wzgl´du na du˝y zakres pr´˝noÊci jest wyra˝ane jako pF, które jest ekwiwalentem logarytmu cm s∏upa wody. PojemnoÊç polowa jest definiowana jako iloÊç wody, która mo˝e byç zatrzymana wzgl´dem grawitacji przez naturalnà gleb´ 2 dni pod d∏u˝szym okresie opadów lub odpowiednim nawodnieniu. OkreÊlana jest w glebie niewzruszonej in situ w warunkach polowych. Pomiaru nie mo˝na wi´c zastosowaç dla gleb laboratoryjnych. WartoÊci FC oznaczone w glebach wzruszonych mogà charakteryzowaç si´ wielkà zmiennoÊcià. PojemnoÊç wodnajest okreÊlana wlaboratorium we wzruszonej iniewzruszonej glebie przez nasycenie kolumny gleby wodà przez transport kapilarny. Jest szczególnie u˝yteczna dla gleb wzruszonych imo˝e byç do 30 % wi´ksza od pojemnoÊci polowej (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Jest tak˝e doÊwiadczalnie ∏atwiejsza do okreÊlenia ni˝ wiarygodne wartoÊci FC. 1) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. TABELA C.23.2: ZAWARTOÂå WILGOTNOÂCI (g wody na 100 g suchej gleby) RÓ˚NYCH RODZAJÓW GLEBY Z RÓ˚NYCH KRAJÓW 1)Ca∏kowita pojemnoÊç wodna.

Schemat: Rysunek C.23.1 Przyk∏ad uk∏adu przep∏ywowego do badania przemian substancji chemicznych w glebie (zobacz pozycje 1 i 2 piÊmiennictwa) 1: zawór iglicowy 2: butla przemywajàca gaz zawierajàca wod´ 3: ultra membrana (tylko w warunkach polowych), rozmiar oczka 0,2 µm 4: kolba metabolizmu gleby (zalewana wodà tylko w warunkach beztlenowych I poletka ry˝owego) 5: pu∏apka z glikolem etylenowym dla lotnych zwiàzków organicznych 6: pu∏apka z kwasem siarkowym dla zasadowych zwiàzków lotnych 7, 8: pu∏apka z wodorotlenkiem sodu dla CO & inne kwasowe lotne 2 9: pomiar przep∏ywu Rysunek C.23.2 Przyk∏ad kolb biometrycznych do badania przemian substancji chemicznych w glebie (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) 1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123—157. 2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85—114. 3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141—146.

Za∏àcznik nr 14 C.24. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W OSADACH WODNYCH 1. METODA cji. Metoda ekstrakcji nie powinna znaczàco zmieniaç samych zwiàzków lub struktury matrycy. Sposób wià- Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opi- zania mo˝e byç cz´Êciowo wyjaÊniony przez zmian´ sanej w Wytycznej OECD nr 308 (2002). sposobu ekstrakcji z matrycy lub wyspecjalizowane techniki analityczne. W taki sposób zidentyfikowano 1.1. Wst´p na przyk∏ad wiàzania kowalencyjno-jonowe i sorpcyjne, a tak˝e „pu∏apki”. Ogólnie tworzenie zwiàzanych Substancje chemiczne mogà wnikaç do p∏ytkich pozosta∏oÊci redukuje znaczàco biodost´pnoÊç i biolub g∏´bokich wód powierzchniowych bezpoÊrednio, przyst´pnoÊç (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa) [zmoprzez sp∏ywy, kanalizacje, ze Êciekami przemys∏owy- dyfikowane wed∏ug IUPAC 1984 (zobacz pozycja11 pimi, komunalnymi lub rolniczymi i opadami atmosfe- Êmiennictwa)]. rycznymi. Niniejsza metoda badawcza opisuje sposób oszacowania tlenowych i beztlenowych przemian Przemiany tlenowe: (utleniajàce) reakcje zachozwiàzków chemicznych w osadach wodnych. Metoda dzàce w obecnoÊci tlenu czàsteczkowego (zobacz pota opiera si´ na istniejàcych Wytycznych (zobacz pozy- zycja 12 piÊmiennictwa). cje 1, 2, 3, 4, 5 i 6 piÊmiennictwa). Na Warsztatach Przemiany beztlenowe: (redukujàce) reakcje za- OECD dotyczàcych wyboru gleb iosadów, które odbychodzàce pod nieobecnoÊç tlenu czàsteczkowego (zowa∏y si´ we W∏oszech, Belgirate w 1995 r. (zobacz pobacz pozycja 12 piÊmiennictwa). zycja 7 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaje osadów do stosowania w niniejszym badaniu. Wody naturalne: wody powierzchniowe pocho- NaWarsztatach podj´to tak˝e zalecenia wzakresie podzàce ze stawów, rzek, strumieni itp. bierania, obróbki i przechowywania próbek osadów w oparciu o Wytyczne ISO (zobacz pozycja 8 piÊmien- Osad: jest mieszaninà mineralnych i organicznych nictwa). Takie badania sà wymagane dla substancji, sk∏adników chemicznych, przy czym te drugie sk∏adajà które sà stosowane bezpoÊrednio na wod´ lub naj- si´ ze zwiàzków o wysokiej zawartoÊci w´gla i azotu prawdopodobniej dostanà si´ do Êrodowiska wodne- iowysokich masach czàsteczkowych. Tworzy si´ wwogo opisanymi powy˝ej szlakami. dach naturalnych ima powierzchni´ kontaktowà zwodà. Warunki panujàce w naturalnych systemach osa- Mineralizacja: jest pe∏nym rozk∏adem zwiàzku ordów wodnych sà cz´sto tlenowe w górnej warstwie ganicznego do CO i H O w warunkach tlenowych 2 2 wodnej. Górna pow∏oka osadu mo˝e byç zarówno tle- oraz CH, CO i H O w warunkach beztlenowych. 4 2 2 nowa, jak i beztlenowa, podczas gdy g∏´bsze warstwy W kontekÊcie niniejszej metody, gdy stosuje si´ zwiàsà zazwyczaj beztlenowe. Dlatego w niniejszym bada- zek znakowany, mineralizacja oznacza rozk∏ad, podniu uj´to metodyk´ zarówno dla warunków tlenowych, czas którego znakowany atom w´gla jest utleniany lub jak i beztlenowych. Badanie w warunkach tlenowych redukowany iloÊciowo z uwolnieniem odpowiedniej symuluje kolumn´ wodnà nasyconà tlenem nad tleno- iloÊci 14CO lub 14CH. 2 4 wà pow∏okà osadu zbeztlenowym pod∏o˝em. Badanie Okres pó∏rozk∏adu: t, jest czasem potrzebnym symuluje ca∏kowicie beztlenowy uk∏ad woda-osad. Je- 0,5 na 50 % przemian badanej substancji, je˝eli przemia- ˝eli okolicznoÊci wskazujà na koniecznoÊç zmiany pony mo˝na opisaç kinetykà pierwszego rz´du; nie zalewy˝szych zaleceƒ na przyk∏ad przez zastosowanie nie- ˝y od st´˝enia poczàtkowego. naruszonych osadów lub osadów, które by∏y nara˝one na badanà substancj´, to dla takich celów dost´pne sà DT (Okres Zanikania 50): jest czasem, w którym inne metody (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). 50 st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o50 %. 1.2. Definicje DT (Okres Zanikania 75): jest czasem, w którym 75 st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o75 %. Nale˝y stosowaç jednostki Mi´dzynarodowego Systemu (SI). DT (Okres Zanikania 90): jest czasem, w którym 90 st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o90 %. Badana substancja:ka˝da substancja, wtym zwiàzek wyjÊciowy i odpowiednie produkty przemian. 1.3. Substancje kontrolne Produkty przemian: wszystkie substancje pocho- Substancje kontrolne powinny byç stosowane cedzàce zreakcji przemian biotycznych lub abiotycznych lem charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przebadanej substancji, w tym CO 2 i zwiàzane pozosta∏o- mian metodami spektroskopowymi lub chromatogra- Êci. ficznymi. Zwiàzane pozosta∏oÊci: „Zwiàzane pozosta∏oÊci” 1.4. Informacje o badanej substancji stanowià zwiàzki wglebie, roÊlinie lub zwierz´ciu, które trwajà w matrycy w postaci zwiàzku wyjÊciowego Dla pomiaru stopnia przemian stosowaç mo˝na lub jego metabolitów/produktów przemian po ekstrak- substancje znakowane i nieznakowane, chocia˝ prefe-

noziarnista” jest zdefiniowana jako zawartoÊç [glina + 1.8.2.2. Opis próbek osad-woda i∏]20 >50 %, a struktura „gruboziarnista” jako zawartoÊç [glina + i∏] <50 %. Ró˝nica w zawartoÊci [glina + Kluczowe parametry, które muszà byç oznaczane i∏] powinna wynosiç przynajmniej 20 %. W przypadku i przedstawiane w sprawozdaniu (z podaniem stosogdy substancja chemiczna mo˝e tak˝e dostaç si´ do wanej metody) zarówno dla osadu, jak iwody, oraz fa- Êrodowiska morskiego, przynajmniej jeden z bada- za badania, wktórej te parametry majà byç oznaczane, nych osadów powinien byç pochodzenia morskiego. przedstawiono w tabeli C.24.1. Metody oznaczania tych parametrów podano w pozycjach 18, 19, 20 i 21 Wprzypadku badaƒ ÊciÊle beztlenowych dwa osapiÊmiennictwa. dy (wraz ztowarzyszàcymi im wodami) nale˝y pobraç ze strefy beztlenowej wód powierzchniowych (zobacz Ponadto inne parametry mogà byç konieczne do pozycja 7 piÊmiennictwa). Zarówno osad, jak i faza oznaczania w konkretnych przypadkach (np. dla wód wodna powinny byç transportowane bez dost´pu tles∏odkich: zawiesina, zasadowoÊç, twardoÊç, przewodnu. nictwo, NO /PO (stosunek i wartoÊci indywidualne); 3 4 Przy wyborze osadu wa˝ne mogà byç tak˝e inne dla osadów: zdolnoÊç wymiany jonów, ca∏kowita poparametry i powinny byç one brane pod uwag´ indy- jemnoÊç wodna, w´glany, fosfor i azot ca∏kowity; dla widualnie dla ka˝dego przypadku. Na przyk∏ad zakres systemów morskich: zasolenie). Analiza osadów iwowartoÊci pH osadu powinien byç wa˝ny w badaniu dy pod wzgl´dem zawartoÊci azotanów, siarczanów substancji, których przemiany i/lub sorpcja mogà byç biodost´pnego ˝elaza i innych biorców elektronów zale˝ne od wartoÊci pH. Zale˝noÊç sorpcji od wartoÊci mo˝e byç tak˝e u˝yteczna w szacowaniu warunków pH mo˝e odzwierciedlaç si´ w wartoÊci pK badanej red-oks szczególnie wodniesieniu do przemian beztlea substancji. nowych. TABELA C.24.1: Pomiar parametrów charakteryzujàcych próbki woda-osad (zobacz pozycje 7, 22 i 23 piÊmiennictwa)

Wszystkie sposoby obliczeƒ majà swoje s∏abe isil- wy wodnej i osadu, rozmiary naczynia doÊwiadne strony i ró˝nià si´ swojà z∏o˝onoÊcià. Za∏o˝enie ki- czalnego), netyki pierwszego rz´du mo˝e byç zbytnim uproszczeniem procesów rozk∏adu i rozmieszczenia, ale je˝eli — podawanie badanej substancji do uk∏adu badawjest to mo˝liwe, to dostarcza wartoÊç (sta∏à lub wartoÊç czego: stosowane st´˝enie, liczba powtórzeƒ pó∏rozk∏adu), która jest ∏atwa w zrozumieniu i ma za- ikontroli, sposób podania badanej substancji (np. stosowanie w modelowaniu symulacyjnym i oblicze- zastosowanie rozpuszczalnika) itp., niach przewidywanych st´˝eƒ Êrodowiskowych. Spo- — temperatura inkubacji, soby empiryczne lub transformacje liniowe mogà dawaç lepsze dopasowanie krzywych do danych i przez — czasy pobierania prób, to pozwalaç na lepsze oszacowanie okresów pó∏rozpadu, wartoÊci DT i, je˝eli to w∏aÊciwe, wartoÊci DT — metody ekstrakcji i ich wydajnoÊci, a tak˝e meto- 50 75 i DT. Zastosowanie wyprowadzonych sta∏ych jest dy analityczne i granice oznaczalnoÊci, 90 jednak ograniczone. Modele przedzia∏owe mogà wygenerowaç wiele po˝ytecznych sta∏ych o wartoÊci — metody charakteryzacji/identyfikacji produktów w oszacowaniu ryzyka, które opisujà stopieƒ rozk∏adu przemian, w ró˝nych przedzia∏ach i rozproszenie substancji. Po- — odchylenia od sposobu post´powania lub warunwinny byç one tak˝e stosowane do szacowania sta∏ych ki podczas doÊwiadczenia. stopnia tworzenia i rozpadu g∏ównych produktów przemian. We wszystkich przypadkach zastosowana Wyniki: metoda musi mieç swoje uzasadnienie, aosoba wykonujàca doÊwiadczenie powinna wykazaç graficznie — dane pierwotne reprezentatywnych analiz i/lub statystycznie dobroç dopasowania. (wszystkie dane pierwotne nale˝y przechowywaç w archiwum zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki 3. SPRAWOZDANIE Laboratoryjnej), 3.1. Sprawozdanie koƒcowe — powtarzalnoÊç i czu∏oÊç stosowanych metod analitycznych, Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´- pujàce informacje: — stopieƒ odzysku (wartoÊci % dla zwalidowanego badania podano w pkt 1.7.1), Badana substancja: — przedstawione w postaci tabel wyniki wyra˝one — nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer jako % stosowanej poczàtkowej dawki i jako CAS, wzór strukturalny (wskazujàc pozycj´ znacz- mg/kg w wodzie, osadzie i ca∏ym systemie (tylników, gdy stosowano materia∏ znakowany radio- ko%) dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, aktywnie) i wa˝ne w∏asnoÊci fizykochemiczne, dla produktów przemian i nieekstrahowalnej radioaktywnoÊci, — czystoÊç (zanieczyszczenia) badanej substancji, — bilans masy podczas i na koniec badania, — czystoÊç radiochemiczna znakowanego zwiàzku i specyficzna aktywnoÊç (gdy to w∏aÊciwe). — graficzne przedstawienie przemian w wodzie i osadzie oraz w ca∏ym systemie (w tym minerali- Substancja kontrolna: zacja), — nazwa chemiczna istruktura substancji kontrolnej — stopnie mineralizacji, stosowanej do opisu i/lub identyfikacji produktu przemiany. — okres pó∏rozpadu iwartoÊç DT oraz, gdy to w∏a- 50 Êciwe, wartoÊci DT iDT dla badanej substancji 75 90 Badane osady i wody: i,gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian wraz z przedzia∏ami ufnoÊci w wodzie, osa- — szczegó∏y dotyczàce miejsca pobrania, dodajàc, dzie i ca∏ym uk∏adzie, je˝eli to mo˝liwe, dane archiwalne dotyczàce zanieczyszczeƒ, — oszacowanie kinetyki przemian dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produk- — wszystkie informacje dotyczàce pobierania, okre- tów przemian, su przechowywania (je˝eli by∏a przechowywana) i aklimatyzacji uk∏adów woda-osad, — proponowane szlaki przemian, gdy to w∏aÊciwe, — w∏asnoÊci prób woda-osad jak przedstawiono — dyskusja wyników. w tabeli C.24.1, w pkt 1.8.2.2. 4. PIÂMIENNICTWO Warunki badania: 1) BBA-Guidelines for the examination of plant pro- — stosowany uk∏ad badawczy (np.: przep∏ywowy, tectors in the registration process. (1990). Part IV, biometryczny, sposób wentylacji, metoda miesza- Section 5—1: Degradability and fate of plant pronia, obj´toÊç wody, masa osadu, gruboÊç pokry- tectors in the water/sediment system. Germany.

2) Commission for registration of pesticides: Appli- tes. Studies with 14C-labelled model surfactants. cation for registration of a pesticide. (1991). Part Water Research 21, 661—667. G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Nether- 18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agrolands. nomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradabi- 19) APHA (1989). Standard Methods for Examination lity tests on pesticides in natural sediment/water of Water and Wastewater (17thedition). American systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom. Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federa- 4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and tion, Washington D.C. fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) — Anaerobic 20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Apand aerobic. Canada. pp. 35—37. plications. Longman. 5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdi- 21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox povision N. Chemistry: Environmental fate (1982). tential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038— Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism. 1039. 6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for 22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance doassessing the environmental fate and ecotoxicity cument on testing procedures for pesticides in of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Eurofreshwater mesocosms. From the Workshop pe, Brussels. „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3—4 July 1991. 7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of So- 23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance doils/sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995. cument on sediment toxicity tests and bioassays 8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sam- for freshwater and marine environments. From pling — Part 12: Guidance on sampling of bottom the Workshop On Sediment Toxicity Assessment sediments. (WOSTA), 8—10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach. 9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines 24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesti- (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080. cide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field si- 10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wi- tes. Water Research 31, 2858—2868. ley–VCH (1998). 25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. 11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues (1999). Nutrient effects on microbial transformain soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945—956 tion of pesticides in nitrifying waters. Environ. To- (IUPAC 1984). xicol, 329—338. 12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegrada- 26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenanbility in Soil (adopted 12 May 1981). ce carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. 13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Soil Biol. Biochem. 17, 197—203. Paris. OECD (1994—2000): Addenda 6—11 to Guidelines for the Testing of Chemicals. 27) ISO–14240–2. (1997). Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 2: Fumiga- 14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. tion-extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 Ja- (1988) Degradation of pesticides in an aquatic mokoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroordel ecosystem. BCPC — Pests and Diseases, 3B-4, ganizmów w glebie — Metoda fumigacji — eks- 149—158. trakcji. 15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress 28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinein Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Ro- tics of the Degradation of Chloroform and Benzeberts, Eds.), Vol. 1, 85—114. J. Wiley & Sons. ne in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13—21. 16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on de- 29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General megradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in thod for determining anaerobic biodegradation soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631—637. potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850—857. 17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degra- 30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., dation of detergent range fatty alcohol ethoxyla- Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J.

(1989). Screening of chemicals for anaerobic bio- nants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, degradation. Chemosphere 19, 1527—1550. 961—968. 31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic 35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistibiodegradation tests for organic compounds. cal interpretation and graphic representation Chemoshpere 27, 1499—1509. of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 39, 32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test 187—203. for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic condi- 36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretations. Environ. Sci. Technol. 30, 3597—3603. tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzen- 33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of or- schutz-Nachrichten Bayer, 33, 47—60. ganic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090. 37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of 34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of stora- pesticides in sediment/water systems. Brighton ge on sediment characteristics and drying sedi- Crop Protection Conference — Pest and Diseases, ment on sorption coefficients of organic contami- pp. 1349—1354. WYTYCZNE DO BEZTLENOWYCH I TLENOWYCH UK¸ADÓW BADAWCZYCH Tlenowy uk∏ad badawczy Beztlenowy uk∏ad badawczy W przypadku beztlenowego uk∏adu badawczego Tlenowy uk∏ad badawczy opisany wniniejszej mesposób post´powania jest taki sam, jak opisany dla todzie badawczej sk∏ada si´ z tlenowej warstwy woduk∏adu tlenowego, z wyjàtkiem tego, ˝e nad ponej (typowe st´˝enia tlenu wzakresie od 7 do 10mg/l) wierzchnià wody w ka˝dej jednostce inkubacyjnej i warstwy osadu, tlenowej na powierzchni i beztlenoprzepuszczany jest azot, by utrzymaç jego wystarczawej poni˝ej powierzchni (typowy zakres potencja∏u jàcà iloÊç. Osad i wod´ uwa˝a si´ za beztlenowe, gdy red-oks (E) w strefie beztlenowej osadu w zakresie h potencja∏ red-oks (E) jest ni˝szy ni˝ –100 mV. od –80 do –190 mV). Nawilgocone powietrze jest h przepuszczane nad powierzchnià wody w ka˝dej jed- W badaniu beztlenowym do oszacowania mineranostce inkubacyjnej, aby utrzymaç wystarczajàcà lizacji zalicza si´ pomiar powsta∏ego dwutlenku w´gla iloÊç tlenu. i metanu.

RYSUNEK C.24.1 PRZYK¸AD GAZOWEGO URZÑDZENIA PRZEP¸YWOWEGO

RYSUNEK C.24.2 PRZYK¸AD URZÑDZENIA BIOMETRYCZNEGO PRZYK¸AD OBLICZE¡ DAWKI DO NACZY¡ DOÂWIADCZALNYCH Wewn´trzna Êrednica cylindra: = 8 cm G∏´bokoÊç kolumny wody, nie wliczajàc osadu: = 12 cm Pole powierzchni: 3,142 x 42 = 50,3 cm2 Dawka: 500 g badanej substancji/ha odpowiada 5 µg/cm2 Ca∏kowite µg: 5 x 50,3 251,5 µg Dostosowaç iloÊç w odniesieniu do g∏´bokoÊci 100 cm: 30,18 µg 12 x 251,5÷100 Obj´toÊç kolumny wody: 50,3 x 12 603 ml St´˝enie w wodzie: 30,18÷603 0,050 µg/ml lub 50 µg/l